Luktämne-inducerade svar in från luktreceptorceller Nervceller användning av tekniken Sug Pipettera
Summary
Luktreceptorceller neuroner (Örns) omvandlar lukt signaler först till en receptor ström som i sin tur utlöser aktionspotentialer som förmedlas till andra ordningens neuron i luktbulben. Här beskriver vi tekniken sug pipett för att spela in samtidigt luktämnen-inducerad receptor ström och potentialer åtgärder från mus Örns.
Abstract
Djur prov på illaluktande miljön omkring dem genom chemosensory system som finns i näshålan. Chemosensory signaler påverkar komplexa beteenden såsom mat val, rovdjur, conspecific och mate erkännande och andra socialt relevanta ledtrådar. Luktreceptorceller neuroner (Örns) ligger i den dorsala delen av näshålan inbäddad i luktepitel. Dessa bipolära nervceller skickar ett axon till luktloben (se Fig. 1, Reisert & Zhao 1, ursprungligen publicerad i Journal of General Physiology) och utöka en enda dendrit till epiteliala gränsen där Cilia stråla in i slem som täcker lukt epitel. Flimmerhåren innehåller maskinen signaltransduktion som slutligen leder till excitatoriska nuvarande inflöde genom ciliära transduktion kanaler, en cyklisk nukleotid-gated (CNG) kanal och en Ca 2 +-aktiverad CL – kanal (bild 1). Den påföljande depolarization triggar aktionspotentialen generationen på cellkroppen 2-4.
I den här videon beskriver vi användningen av "sug pipett teknik" för att spela in luktämne-inducerade svar från Örns. Denna metod utvecklades ursprungligen för att spela in från spö fotoreceptorer 5 och en variant av denna metod kan hittas på jove.com modifierats för att spela in från fotoreceptorer mus kon 6. Sug pipett Tekniken anpassades senare att även spela in från Örns 7,8. Kortfattat, efter dissociation av luktepitel och cellisolering, är hela cellkroppen av en ORN sugs in i spetsen av en inspelning pipett. Den dendrit och flimmerhåren förblir exponerade till badlösningen och därmed tillgänglig för lösning ändras för att möjliggöra t.ex. luktämne eller farmakologisk blockerare applikation. I denna konfiguration är ingen tillgång till den intracellulära miljön fått (ingen hel-cellspänning klämma) och den intracellulära spänningen förblir fri att variera. Detta alltows samtidig inspelning av den långsamma receptorn ström som har sitt ursprung i flimmerhåren och snabba potentialer åtgärder eldas med cellkroppen 9. Skillnaden i kinetik mellan dessa två signaler medger att de kan separeras med användning av olika filter inställningar. Denna teknik kan användas på alla vildtyp eller knockout-mus eller att spela selektivt från Örns som också uttrycker GFP att märka specifika undergrupper av Örns, t.ex. uttrycker en given luktreceptor eller jonkanal.
Protocol
Discussion
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH DC009613, Human Frontiers Science Program och Morley Care Fellowship (till JR).
Materials
| Name of the material | Tipo | Company | Catalogue / Model number |
Comments |
| Air table | equipment | Newport | ||
| Air Pump | equipment | Newport | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | WPI | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom-made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn Hite corporation | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | WPI | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom-made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 |
equipment | Sutter Instrument | Micromanipulator MP85-1028 |
|
| Mineral oil | Solution | Sigma | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | Automate Scientific | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner |
Riferimenti
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
- Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
- Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).
- Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
- Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13 (1999).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).
