实时定量PCR（qPCR的microRNA检测在前列腺肿瘤）
Summary
实时定量聚合酶链反应（QPCR）是一种快速，灵敏的方法来探讨不同的microRNA（miRNA）的分子的表达水平在肿瘤样本。使用此方法数百种不同的miRNA分子表达可以被放大，量化，并从相同的cDNA模板分析。
Abstract
小分子RNA（miRNAs）是单链，18-24核苷酸长，非编码RNA分子。他们参与几乎每一个细胞的过程，包括发展1 2，细胞凋亡，细胞周期调控3。估计miRNA的调节表达的30％到90％的人类基因4，结合他们的目标信使RNA（mRNA）5。据报道，在各种疾病和癌症亚型6 miRNA的普遍失调。由于他们的患病率和独特的结构，这些小分子有可能成为下一代的生物标志物，治疗药物和/或目标。
调查miRNA表达的方法，包括SYBR Green I染料为基础，以及基础的TaqMan探针定量PCR。如果miRNA是在临床上得到有效使用，这是当务之急，他们在新鲜和/或存档的临床标本的检测准确，重现性好，和SPecific。定量PCR已被广泛用于验证在整个基因组的分析，如基因芯片研究7 miRNA的表达。在本协议所使用的样本例临床局限性前列腺癌根治性前列腺切除术的患者;然而，其他组织和细胞株可以取代英寸前列腺标本在液氮单元冷冻切除后。为每一个病人的临床变量和后续信息收集为后续的分析8。
量化前列腺肿瘤样本中miRNA的水平 。在肿瘤的qPCR分析的主要步骤是：总RNA提取，cDNA合成，定量PCR产品检测miRNA的特异性引物。使用TRIzol试剂标本中提取总RNA，其中包括表达的miRNA，和其他小分子RNA。 QIAGEN的miScript系统被用来合成cDNA，并进行定量PCR（ 图1）。内源性miRNA是不是宝在逆转录过程中lyadenylated，因此，聚（A）聚合酶polyadenylates的miRNA。 miRNA的作为模板，使用Oligo-dT和逆转录合成cDNA。对通用标签序列的寡-dT引物5月底，有利于扩增的cDNA PCR步骤。用SYBR Green intercalates双链DNA，染料发出的荧光水平检测PCR产物的扩增。特定miRNA的引物，随着通用标签序列的通用引物结合，将扩增特定的miRNA序列。
有超过一千人特定的miRNA，和数以百计的小鼠特定miRNA的miScript底漆检测。相对定量方法是使用量化miRNAs的表达。要纠正不同样品之间的变异性，目标的miRNA的表达水平正常化的参照基因的表达水平。选择一个GENE正常化的目标表达相对定量分析方法是至关重要的。在这方面的能力通常使用的参照基因的例子是小分子RNA RNU6B，RNU44，并RNU48，他们表示在大部分样本都被认为是稳定。在这个协议中，被用来作为参照基因RNU6B。
Protocol
Discussion
已不断发现一些miRNA的异常表达在前列腺肿瘤中比正常组织，这些miRNAs部分已命名为潜在的新的治疗药物，预防前列腺癌的11。因此，miRNA的异常表达水平可能是有用的诊断和/或预后标志物。这里提供实时定量PCR方法检测前列腺肿瘤组织中miRNA的水平准确的量化。使用的miScript PCR系统可以检测单核苷酸成熟的miRNA之间的差异。的miScript miRNA的qPCR实验，然而，不用于茎环结构的miRNA前?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由加拿大癌症协会研究所资助的，不授予。 019038。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | |
| Light Cycler Capillaries | Roche | 04929292001 |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | 2538 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
Riferimenti
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790 (2003).
- Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).
- Friedman, R. C. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-281 (2004).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).
- Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).
- Gordanpour, A. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer. Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).
- Nam, R. K. Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer. Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).
- Ambs, S. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68, 6162 (2008).
- Liu, C. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat. Med. 17, 211 (2011).
