调查miRNA表达的方法,包括SYBR Green I染料为基础,以及基础的TaqMan探针定量PCR。如果miRNA是在临床上得到有效使用,这是当务之急,他们在新鲜和/或存档的临床标本的检测准确,重现性好,和SPecific。定量PCR已被广泛用于验证在整个基因组的分析,如基因芯片研究7 miRNA的表达。在本协议所使用的样本例临床局限性前列腺癌根治性前列腺切除术的患者;然而,其他组织和细胞株可以取代英寸前列腺标本在液氮单元冷冻切除后。为每一个病人的临床变量和后续信息收集为后续的分析8。
量化前列腺肿瘤样本中miRNA的水平 。在肿瘤的qPCR分析的主要步骤是:总RNA提取,cDNA合成,定量PCR产品检测miRNA的特异性引物。使用TRIzol试剂标本中提取总RNA,其中包括表达的miRNA,和其他小分子RNA。 QIAGEN的miScript系统被用来合成cDNA,并进行定量PCR( 图1)。内源性miRNA是不是宝在逆转录过程中lyadenylated,因此,聚(A)聚合酶polyadenylates的miRNA。 miRNA的作为模板,使用Oligo-dT和逆转录合成cDNA。对通用标签序列的寡-dT引物5月底,有利于扩增的cDNA PCR步骤。用SYBR Green intercalates双链DNA,染料发出的荧光水平检测PCR产物的扩增。特定miRNA的引物,随着通用标签序列的通用引物结合,将扩增特定的miRNA序列。
Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR). J. Vis. Exp. (63), e3874, doi:10.3791/3874 (2012).