1. Fabricación de chips Crear la solución de revestimiento para el chip, empezando con la solución de precursor de silicato hidrolizado. Mezclar 14 ml de tetraetilortosilicato (TEOS) con 17 ml de etanol, 6,5 ml de agua desionizada y 0,5 ml de HCl 6M bajo fuerte agitación (1200 rpm) usando un revolver placa caliente. Calentar esta solución a 80 ° C durante 2 horas, manteniendo la agitación constante. Se preparan soluciones de polímero mediante la adición de la deseada tri-bloque coploymer (Pluronic F127, L121 y P123) a 10 ml de etanol a temperatura ambiente con fuerte agitación. Completa la mezcla por adición de 7,5 ml de la solución de silicato (del paso 1,1) en la solución del copolímero tri-bloque seguido de 2 horas de fuerte agitación a temperatura ambiente. Esto representa la solución de revestimiento final. Aplicar 1 ml de solución de revestimiento a una oblea de silicio de 4 pulgadas por recubrimiento por rotación a una velocidad de 1500 rpm durante 20 segundos. Entonces el calor a 80 ° C durante 12 horas. Calentar las películas para quitar Su orgánicarfactant elevando la temperatura de 1 ° C por minuto hasta 425 ° C y hornear durante 5 horas. Trate previamente la sílice mesoporoso (MPS) con la superficie del chip incineración con plasma de oxígeno (Plasma Asher – marzo de plasma del sistema). (O 2 Caudal: 80 cm ³, potencia: 300 W, tiempo: 10 minutos). Opcional superficie modificación química: virutas silanate en 3% en un organosilano metanol: agua DI (19:1) solución durante 72 horas a temperatura ambiente en un N 2 guantera. Enjuagar secuencialmente con metanol y agua desionizada. Cure fichas a 110 ° C durante 15 minutos en un horno con ventilador accionado. 2. Ejemplo de Pre-tratamiento Añadir TFA y ACN para cada muestra de suero de tal manera que las concentraciones finales son 0,01% de TFA y 5% de ACN. Vortex para mezclar. Agitar estas muestras en una mesa de vórtice agitador a temperatura ambiente durante 30 minutos. 3. El fraccionamiento de suero Pre-hornear virutas durante la noche en un horno a 160 ° C. Por otra parte, almacenamientoe las fichas en un desecador hasta su utilización para evitar la hidratación de la superficie por el agua en el aire ambiente. El uso de aire comprimido a desempolvar cualquier partícula que pueda haber en la superficie del chip. Cortar prefabricado, comprado CultureWell cámaras cubreobjetos para incluir el número deseado de pozos. Cubreobjetos limpia con etanol al 100% y luego colóquela sobre una superficie de chips de MPS. Presione hacia abajo cubreobjetos con unas pinzas para asegurar un sellado completo con chip. Pipetear 10 L de muestra de suero en cada uno de 3 mm bien. Incubar durante 30 minutos en una cámara humidificada, a temperatura ambiente. Pipeta hasta el suero de los pozos y deseche. Pipetear 10 L de agua desionizada a cada pozo para lavar proteínas más grandes. Repite 4 veces. Verter de 5 l de tampón de elución (0,1% TFA + 50% ACN) a cada pocillo de la muestra. Pipetear arriba y hacia abajo 30 veces mientras se mueve alrededor de la punta de la pipeta en el pozo para mezclar el tampón de elución. (Solamente se aplican tampón de elución a 1-2 muestras en un tiempo para evitar tampón de eluciónse evapore tan rápidamente). Después de mezclar, pipetear todo el tampón de elución y colocar en un tubo de microcentrífuga hasta que esté listo para realizar análisis MALDI-TOF. Con el fin de emular la complejidad de una muestra biológica y para evaluar el efecto de enriquecimiento en la cosecha de las especies de bajo peso molecular con nuestro sistema de fraccionamiento en el chip, se seleccionaron y se reunió una mezcla estándar de proteínas y péptidos de conteo veintiséis especies diferentes con una amplia distribución de pesos moleculares (900-66 500 Da) y PI (4,0 a 10,2) y concentraciones (0.5-8 pmol / l) (véase la lista de proteína en la Tabla 1). 4. MALDI-TOF análisis de los péptidos Punto 0.5 l de la muestra a la placa de MALDI objetivo y dejar secar. Punto 0,5 matriz l (α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA), 5 g / l) o una solución saturada de ácido trans-3 ,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico (SA) en 50% de acetonitrilo que contenía 0,1% de TFA y permitir a co-cristalización. </Li> Punto 0.5 l de solución de calibración para cada punto de calibración y deje que se seque. Inserte la placa de destino en el espectrómetro de masas MALDI-TOF. La máquina debe estar configurado en modo positivo con un reflector de la intensidad del láser de 4200 y 3000 disparos por ejemplo. El rango de masas seleccionado debe ser 800 a 5000 Da con una masa objetivo de 2000 Da. Realice mismo análisis MALDI-TOF en el modo lineal, sino cambiar el rango de masas de 900 a 10.000 Da o Da 3000 a 70.000 y una masa objetivo de 5000 Da. 5. Análisis de Datos Los espectros de crudo fueron procesados con el software ConvertPeakList y los datos se exportan a SpecAlign software para procesamiento previo. Todos los espectros fueron alineados utilizando el método de correlación PAFFT y las intensidades se normalizaron a la corriente total de iones (TIC) en cada espectro correspondiente. Todos los espectros se alisa y se de-divulgó con el factor de 4 y 0,5, respectivamente. Los picos se detectaron con una línea de base de 0,5 ventana de masa, de 21 y la alturaratio de 1,5, los valores negativos fueron retirados antes del análisis. La agrupación jerárquica se ha realizado mediante Cluster 3.0 y visualizados con el software de Mapletree. MALDI MS de datos (m / z pico de intensidad) es log-transformados, normalizada, y centrado en la mediana. De correlación de Pearson se utilizó para calcular la distancia entre las muestras, y la agrupación de ligamiento completo se realizó. Un estudiante independiente t-test fue utilizado para la comparación entre los grupos (n = 2 grupos) para cada pico detectado MS antes del análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado. Un valor de p de 0,02 o menos fue considerado significativo para seleccionar los péptidos y las proteínas diferencialmente cosechados entre los distintos chips de mesoporosos proteómicos (poros grandes frente a pequeños poros). 6. Los resultados representativos Como se muestra en la Figura 1, en este estudio se han fabricado una serie de películas delgadas de sílice mesoporosos con una variedad de nanotextures y explorado exhaustivamente elIR en uso selectivo Figura 2a capturar y enriquecer péptidos y proteínas LMW partir de suero humano. yb muestran los espectros de MS de la muestra de suero sin procesar para péptidos en el intervalo de 900 a 10.000 Da y para las proteínas en el intervalo de 3.000 ~ 70.000 Da, respectivamente . Estos espectros ilustran la supresión de la señal en la región LMW debido a la presencia de bien ionizado, muy abundante, de alto peso molecular (HMW) de proteínas tales como albúmina. Figura 2c y d muestran los espectros de MS de la muestra de suero después de fraccionamiento por el L121 MPS (tamaño de poro, 6 nm). La mayoría de las moléculas grandes se han agotado, resultando en un enriquecimiento significativo de los componentes LMW. Como control, la misma muestra de suero se aplicó sobre una superficie no porosa de sílice puro para evaluar la especificidad de las películas delgadas de MPS para la recuperación PBPM. Como puede verse en la Figura 2e y f, no hubo cosecha significativa de peplas mareas o las proteínas de la sílice porosa. Así se puede concluir que era la arquitectura mesoporoso y no la afinidad superficie de la sílice que constituye el factor predominante en el enriquecimiento de PBPM. Precisamente controladas variaciones en el tamaño de poro se puede lograr mediante el uso de copolímeros con diferentes longitudes de bloques hidrófobos. Mediante el uso de las proteínas y la mezcla de péptidos diseñados, el efecto del tamaño de poro en el péptido LMW y la eficacia de recuperación de proteína se investigó utilizando MPS películas delgadas preparadas a partir de cuatro tensioactivos Pluronic (F127, P123, L121, L121 y más agente de hinchamiento) con diferentes relaciones de volumen de los componentes hidrófilos e hidrófobos para formar tamaños de poro de 3,7 nm, 5.2, 7.4 nm y 9,0 nm, respectivamente. Esta gama de tamaños de poro condujo a la recuperación de un repertorio diferente de péptidos y proteínas a partir de la misma muestra de suero a través de tamaño y forma de exclusión (Figura 3). Los espectros de proteínas de alto peso molecular en demonstrate el corte molecular de cada tipo de chip. Además de la reducción dependiente del tamaño de las proteínas de alto peso molecular, el fraccionamiento en el chip de la solución de estándares muestra un diferencial y el enriquecimiento selectivo de especies LMW asociados con los tamaños de poro. El agrupamiento de dos vías jerárquico presenta en la Figura 3b muestra el patrón LMW normas enriquecimiento obtenido con el MSC diferente. Incluso si todos los péptidos están por debajo del corte molecular de los chips, existe una correlación positiva entre los tamaños de poro y el peso molecular de las especies atrapadas. El MSC con poros grandes, de hasta 9 nm, preferentemente cosechar grandes péptidos, péptidos más pequeños mientras se recuperan más eficazmente por los chips con poros más pequeños. La transformación estructural de la disposición mesoporoso se llevó a cabo mediante la regulación de la concentración del polímero plantilla. El aumento de la concentración del polímero plantilla resultó en una curvatura reducida interfacial entre las fasesdel agua, el copolímero, y el silicato, por consiguiente, iniciando la progresión interrelacionada de un esférico a una estructura cilíndrica. Pluronic F127, con su alto peso molecular, posee este alto grado de periodicidad estructural. Al aumentar la concentración de F127 en el inicio de solución, diferentes nanoestructuras MPS película delgada periódicos se puede obtener de nanoestructura 3D para nanoestructura 2D. Las nanoestructuras 3D cúbicos y hexagonales de nido de abeja, que posee la interconexión nanopore más deseable y la morfología de nanopore más accesible, exhiben un rendimiento superior en forma selectiva enriquecer péptidos de BPM que la estructura hexagonal 2D, a pesar de que comparten las mismas distribuciones de tamaño de poro y la misma moleculares de corte para el suero fraccionamiento (Figura 4). También simplificado la conjugación de organo-silano en los chips de MPS mediante la introducción de plasma de oxígeno calcinación para pretratar la superficie del chip. Con el fin de estudiar cualitativamente el efecto electrostático en selectoive en el chip de enriquecimiento, se utilizan las proteínas y la mezcla de péptidos. MS análisis de la solución de estándares proteómicos fraccionó en los chips de MPS preparados con L121 y conjugados con los grupos funcionales químicos se presentan en la Figura 5. La carga positiva y negativamente cargado los péptidos y proteínas LMW son capturados en el aniónico y los chips catiónicos respectivamente. La comparación cuantitativa de los chips de MPS múltiples en la recuperación de los péptidos con carga neta positiva se muestra en la Figura 5a. Los chips con carga negativa y las fichas sin ningún tipo de modificación (con un cargo negativo menor originalmente) muestran el enriquecimiento significativamente mayor para los péptidos que los chips modificados con APTES (-NH 2). A la inversa, los chips cargados positivamente MPS poseen capacidad excepcional para recuperar esos péptidos con carga neta negativa, como se demuestra en la Figura 5b. Mientras α-endorfina no muestra un cambio significativo due a su PI alrededor de 6. Figura 1. Principio de MPS fraccionamiento fichas y el enriquecimiento de BPM. Después muestra manchas en la superficie, las proteínas y péptidos LMW están atrapados en los poros, mientras que las especies más grandes se mantuvo fuera de los poros y se elimina durante las etapas de lavado. Las fracciones enriquecidas se eluyen a continuación y se analizaron por MALDI. Figura 2. Enriquecimiento péptido utilizando los chips de sílice mesoporosos de película delgada. MALDI MS perfiles, tanto en el rango de masa baja (900 a 10 000 Da) y el rango de masas de alta (3000 a 70 000 Da) antes de (a, b) y después (c, d) el tratamiento de suero en las películas delgadas de sílice mesoporosos ( L121, de 6 nm). La recuperación molecular se reduce significativamente cuando se utiliza en blanco superficies no porosas de sílice (e, f). <img alt="Figura 3" src="/ Files/ftp_upload/3876/3876fig3.jpg" /> Figura 3. Enriquecimiento molecular de corte y el tamaño depende de los chips de MPS. (A) vista ampliada de los espectros de MALDI demostrando la característica molecular de corte de cada uno de los chips MPS correlacionan con el tamaño de poro. (B) la agrupación de dos vías jerárquicas de las características de una mezcla de péptidos entre los diferentes chips. La intensidad del color rojo o amarillo indica la concentración de péptido relativa. Poros más grandes mejorado la recolección de grandes péptidos (3600 a 8500 Da), mientras que los péptidos pequeños (900 a 3500 Da) se recuperaron preferentemente desde los chips con poros más pequeños. Figura 4. Caracterizaciones físicas de películas delgadas de MPS y la recuperación selectiva con diferentes nanoestructuras. XRD patrones (a, b, c), TEM (recuadro a, b, c), Pluronic F127 a diferentes concentraciones en la solución de precursor: 4,0 x10 -3 M (una), 6,0 x 10 -3 M (b), y 8,0 x 10 -2 M (c). (D) del gráfico de barras de la intensidad de detección que ilustra la recuperación selectiva péptidos en 3D cúbicos y 3D hexagonales F127 virutas proteómicos (Cub y hexagonal, respectivamente). Las modificaciones estructurales diferentes presentar un enriquecimiento selectivo. Figura 5. Carga específica de recuperación para los chips con funciones de superficie. Barra gráfica de la intensidad de MS de detección de péptidos selectivamente capturadas en los chips funcionalizados. De acuerdo con su punto isoeléctrico, los péptidos son carga positiva o negativa a pH 7,0. (A) péptidos positivos ((1) des-Arg1-bradiquinina, (2) La bradiquinina, (3) la sustancia P-amida, (4) neurotensina, (5) de ACTH (1-17), (6) de ACTH (7 – 38)) están específicamente enriquecido en la carga negativa-surcaras. (B) péptidos negativos ((7) Glu1-fibrinopéptido B, (8) α-endorfina, (9) de insulina de ACTH (18-39), (10), (11) de EGF, (12) similar a la insulina GFII) son específicamente enriquecido en las superficies de carga positiva. Figura 6. On-chip de estabilización de suero fraccionado. (A) Representante perfiles MALDI de péptidos y proteínas LMW eluye inmediatamente después de fraccionamiento de suero (la parte superior) o después de 3 semanas de on-chip de almacenamiento a temperatura ambiente (inferior). (B) De arriba a abajo: el análisis de regresión lineal de las intensidades medias de los picos detectados de EM en cada repetición en comparación con el replicar de un recién fraccionado de suero y se fraccionó suero después de MPS 3wk de almacenamiento de los chips a temperatura ambiente. La ecuación, CV y el coeficiente de determinación (R 2) se indican.