Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging
Summary
In questo articolo descriviamo un metodo che utilizza multi-spettrale di citometria a flusso di imaging per quantificare l'interiorizzazione delle nanoparticelle polianidride o batteri da parte delle cellule RAW 264.7.
Abstract
Sistemi di nanoparticelle sono emersi come strumenti preziosi nella consegna vaccino attraverso la loro capacità di fornire in modo efficiente merci, ivi compresi le proteine, le cellule presentanti l'antigene 1-5. Internalizzazione di nanoparticelle (NP) da cellule presentanti l'antigene è un punto critico nel generare una risposta immunitaria all'antigene incapsulato. Per determinare come le alterazioni della funzionalità impatto formulazione di nanoparticelle, abbiamo cercato di sviluppare un elevato throughput, il protocollo sperimentale quantitativa che fosse compatibile con rilevare le nanoparticelle internalizzate così come batteri. Ad oggi, due tecniche indipendenti, microscopia e citometria di flusso, sono stati i metodi utilizzati per studiare la fagocitosi di nanoparticelle. La natura throughput elevato della citometria a flusso genera solidi dati statistici. Tuttavia, a causa della bassa risoluzione, non riesce a quantificare con precisione internalizzati contro cellule nanoparticelle associati. Microscopia genera immagini ad alta risoluzione spaziale; hazione sul mercato, è in termini di tempo e coinvolge campioni di piccole dimensioni 6-8. Multi-spettrale citometria a flusso di immagini (MIFC) è una nuova tecnologia che incorpora aspetti di microscopia e di citometria a flusso che esegue multi-color immagini spettrali di campo fluorescenza e luminoso simultaneamente attraverso un nucleo laminare. Questa funzionalità fornisce un'analisi accurata di intensità di segnale fluorescenti e le relazioni spaziali tra le diverse strutture e funzioni cellulari ad alta velocità.
Qui, descriviamo un metodo che utilizza MIFC per caratterizzare le popolazioni di cellule che hanno interiorizzato nanoparticelle polianidride o Salmonella enterica sierotipo Typhimurium. Si descrivono anche la preparazione di sospensioni di nanoparticelle, etichettatura cellulare, su un sistema di acquisizione ImageStream X e l'analisi dei dati utilizzando l'applicazione IDEE. Abbiamo inoltre dimostrato l'applicazione di una tecnica che può essere utilizzata per differenziare il p internalizzazioneathways per nanoparticelle e batteri utilizzando citocalasina-D come un inibitore di actina-mediata fagocitosi.
Protocol
Discussion
Studi hanno dimostrato che le nanoparticelle biodegradabili a base di poli (lattico-co-glicolico (PLGA) o polianidridi possono essere usati per fornire antigeni incapsulati o farmaci alle cellule bersaglio. Assorbimento di tali nanoparticelle di cellule fagocitiche è importante per la loro efficacia, rendendo quantitativa . analisi di interiorizzazione critica nella progettazione di nuovi sistemi di consegna delle nanoparticelle Utilizzando questo metodo, assorbimento differenziale di nanoparticelle di vari tipi di cel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) e l'US Army Medical Research e Materiel Command (numeri di sovvenzione W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) per finanziarie sostenere.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 24-well plate | TPP | 92024 | |
| Cell culture Flasks | TPP | 90151 | |
| Cell scraper | TPP | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Harvard Apparatus | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
Riferimenti
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