O álcool polivinílico implantação do modelo Esponja

Summary

Uma ferramenta útil para analisar os efeitos das drogas, os factores de crescimento, e / ou células manipuladas em um modelo animal de reparação de feridas é descrito. Esta técnica utiliza as propriedades de uma esponja de álcool polivinílico (PVA) para fornecer e conter o tratamento desejado e também fornecer uma plataforma para ser excisadas e analisadas.

Abstract

A cicatrização de feridas é um processo complicado de múltiplos passos envolvendo muitos tipos de células, factores de crescimento e de compostos ^1-3. Devido a esta complexidade, os estudos de cicatrização de feridas são mais abrangente quando realizada in vivo. Há muitos modelos in vivo disponíveis para estudar cicatrização de feridas agudas, incluindo incisional, espaço, excisional mortos, e queimaduras. Modelos de espaço morto são artificiais, implantes porosos, que são utilizados para estudar a formação de tecido e os efeitos das substâncias sobre a ferida. Alguns dos mais usados ​​modelos de espaço morto incluem álcool polivinílico (PVA) esponjas, cilindros de aço de malha de arame, expandiram materiais (ePTFE) de politetrafluoretileno, e os ^1,2 Cellstick.

Cada modelo de espaço morto tem suas próprias limitações com base em sua composição material e métodos de implantação. O fio de aço modelo cilindro malha tem uma fase de latência de infiltração após o implante e requer um longo período de tempo antes de tecido de granulação formação begins ^1. Fases mais tardias da cicatrização da ferida são melhor analisadas usando os ^1,4 modelo de ePTFE. O Cellstick é uma esponja de celulose dentro de um modelo de tubo de silicone que é tipicamente usado para estudar feridas cirurgia humana e enrolado fluido ^2. A esponja de PVA está limitado a estudos de toxicidade aguda, porque com o tempo que começa a provocar uma resposta de corpo estranho, que provoca uma reacção de célula gigante no animal ^5. Ao contrário de outros materiais, esponjas de PVA são fáceis de inserir e remover, feita de materiais inertes e não-biodegradável e ainda são suaves o suficiente para ser seccionado para análise histológica ^2,5.

Na cicatrização de feridas da esponja de PVA é muito útil para a análise de formação de tecido de granulação, a deposição de colagénio, a composição do fluido da ferida, e os efeitos das substâncias sobre o processo de cicatrização ^1,2,5. Para além da sua utilização no estudo de um vasto leque de atributos de cicatrização de feridas, a esponja de PVA também tem sido utilizado em muitos outros tipos de estudos. É hcomo foi utilizado para investigar a angiogénese tumoral, a entrega da droga e da sobrevivência de células estaminais e enxerto ^1,2,6,7. Com a sua alterabilidade grande, uso anterior extensa, e resultados reprodutíveis, a esponja de PVA é um modelo ideal para ^1,2 muitos estudos.

Aqui, vamos descrever a preparação, implantação e recuperação de discos de PVA esponja (Figura 1) em um modelo do rato de cicatrização de feridas.

Protocol

1. Preparação Esponja Esponjas de hidrato por agitação durante a noite em 0,9% (w / v) de solução aquosa de cloreto de sódio. Esterilizar esponjas hidratadas em autoclave eles. Para 75 mL autoclave, durante 25 minutos a 121 ° C. Nota: esponjas de carregamento com um tratamento tal como descrito abaixo é opcional. Em um capuz estéril com instrumentos esterilizados, pegar uma esponja a solução usando uma pinça. Comprima a esponja com as pinças e utilizar uma ponta de vácuo para remover a solução de, tanto quanto possível a partir da esponja. Coloque a torcido esponja em um prato de cultura de tecidos, tendo o cuidado de deixar espaço entre as esponjas. Várias placas de poços pode ser usado para separar os diferentes tratamentos. Pipetar a solução de tratamento directamente sobre o centro de uma esponja. Pressione suavemente sobre a esponja com a ponta da pipeta após a solução tenha sido colocado na esponja, o que ajuda a esponja absorver a solução. Nota: A 6 milímetrosdiâmetro por 2,75 mm de espessura esponjas, que empregam são capazes de manter um máximo de 25 uL. Uma vez que todas as esponjas são carregados, a placa que estão em pode ser armazenada em gelo até serem implantados em ratinhos. 2. Procedimento Cirúrgico Apropriadamente anestesiar animais e administrar preventiva analgésico. Todo o processo vai durar aproximadamente 20 minutos por animal. Para um rato de 30 g de 1,5 litros por minuto de oxigénio com 1,5% de isoflurano é utilizado para induzir e manter a anestesia. Quando animais não é mais responsiva ao teste do reflexo pitada, lugar em cone de nariz em posição supina. Use um barbeador elétrico para depilar a 1 polegadas por 1 polegada área na parte inferior do lado ventral abaixo da caixa torácica. Limpe de cabelo cortado. Esterilizar a área raspada pela limpeza com betadine seguido de álcool a 70%. Repita esta limpeza betadine álcool três vezes. Enquanto mantém a pele ensinou, use o bisturi para fazer uma incisão vertical 1,5-2 vezes o diâmetrometro das esponjas para ser inserido, sendo cuidado para não cortar através da cavidade do corpo. Use uma pinça para segurar a ponta da pele e, lentamente, começar a separar a pele a partir do músculo em ambos os lados da incisão utilizando uma tesoura Metzembaum. O bolso deve ir ao longo da largura do rato e da caixa torácica para as patas traseiras. Use uma pinça para pegar a esponja primeiro a ser colocado no animal por beliscar-lo a partir dos lados. Transferir a esponja para uma pinça rectas de modo que seja realizada a partir do topo e no fundo. Use pinças para segurar a ponta da pele e levantá-la de modo que a esponja pode ser inserido. Lentamente inserir a esponja tentar evitar contacto com a pele ou o músculo debaixo como a esponja será difícil para mover uma vez que ela tenha tocado tecido. Repita o procedimento para todas as esponjas. Uma vez que todas as esponjas foram inseridas, coloque dois ou três suturas para fechar a incisão. Use um par de pinças para segurar ambos os lados da incisão em conjunto e enfiar a à suturare através de ambas as camadas de pele. Aperte o primeiro lance apenas o suficiente para fechar as bordas da pele. Termine o nó quadrado com mais um jogar de outra direção, desta vez puxando o nó apertado. Em seguida, amarre dois nós mais quadrados para terminar a sutura (Figura 2). Coloque pontos adicionais para fechar a incisão inteira. Outros métodos de ligação de feridas pode ser utilizado como Dermabond, clipes de feridas, ou grampos. Remover animais do sistema de anestesia e monitorar enquanto a consciência é retomada. Animal deve começar rapidamente a deambulação e voltar ao pré-op mobilidade. Assegurar que eles são capazes de atingir suficientemente comida e água. Alguns alimentar humedecida pode ser colocado no fundo da gaiola para ajudar na recuperação. Continuar a monitorizar animais diariamente para sinais de sofrimento ou desconforto, e verificar o local da incisão para a infecção, deiscência, inflamação e. Tomar as medidas adequadas, se as complicações para a recuperação são encontrados. 3. Injeção Opcional <p class = "jove_content"> Nota: Uma vez que as esponjas foram implantadas no animal que pode ser injectado com uma solução de células, drogas, factores de crescimento, etc Isto permite a análise dos efeitos da substância injectada durante os tempos de entrega variadas e administração regimes. Se as injeções são feitas um controle deve sempre ser usado. Para injectar a esponja com uma solução desejada, primeiro determinar a quantidade de substância para administrar ao rato. A substância tem de ser concentrada de modo que o volume de injecção é inferior a metade do volume total da esponja pode conter. Prepara-se uma seringa para a injecção (para os ratos que usamos um 28 agulha G). Colocar o animal para receber as injecções sob anestesia. Quando o animal já não responde ao teste de pinça a injecção pode ser dada. Para dar a injecção empurrar a agulha com um ângulo de 45 ° a pele do completa no centro da esponja. Em seguida, empurre a agulha na esponja só vai a meio caminhoatravés da sua espessura. O objetivo é injetar no centro exato da esponja. Para verificar para certificar-se a agulha está na esponja, levante lentamente a agulha na vertical. Se a agulha está no esponja, a esponja deve mover-se para cima com a agulha. Lentamente injetar na esponja e retire a agulha. Se houver múltiplos esponjas que requerem injecções, é possível que algum do fluido injectado será empurrada para fora dos sítios anteriores de injecção. 4. Retirada da esponja Nota: Durante a retirada da esponja, lidar com a esponja com cuidado extra. Evitar penetrando a esponja com os instrumentos cirúrgicos e evitar o sangramento excessivo na esponja, evitando as artérias principais em torno do tecido circundante. Depois de o animal é sacrificado, remover a esponja, mantendo a pele usando uma pinça e fazendo uma incisão fechar a esponja. Cuidadosamente separar as esponjas da cápsula em torno de um ª evitar a colheita tecido extra em torno da esponja. Para os ensaios, tais como a entrega da droga ou morfometria, menos precisão é necessária para a excisão. 5. Os resultados representativos Esponjas removidos podem ser armazenados sob condição diferente dependendo do tipo de análise que será executada. Para o corte, as esponjas recuperados pode ser incorporado em um meio de congelamento, tais como temperatura de corte ideal (OCT) composto ou colocados em formalina a 10% para a incorporação e corte em blocos de parafina (Figura 3A e B). Os melhores resultados para o seccionamento são obtidos quando a esponja é cortado ao meio através do diâmetro e incorporado cortar superfície para baixo (Figura 4A e B). Secções da esponja devem ser tomadas de modo a que toda a largura da esponja está presente. 3A Figura mostra duas esponjas, a esponja esquerdo foi incorporado / seccionado de forma incorrecta ea esponja direito foi processado correctamente. ent "> Para a análise, esponjas pode ser colocado em um tubo de Eppendorf e armazenado a -20 ° C até estar pronto para processamento Para RNA e quantitativas em tempo real esponjas análise de PCR deve ser colocado em um tubo de Eppendorf, flash congelado e armazenado a. – 80 ° C. Além disso, um conservante RNA, tais como RNAlater de Qiagen, podem ser usados ​​para estabilizar o RNA de armazenagem segura a temperaturas mais elevadas. fluido da ferida pode ser recolhido por espremendo as esponjas ao longo de um tubo, e agregação de o fluido a partir esponjas múltiplas para obter uma amostra representativa. células vivas, tais como fibroblastos, macrófagos e linfócitos, também pode ser extraído das esponjas. Após a remoção do animal, esponjas podem ser lugar em um meio apropriado para o tipo desejado de células. esponjas podem ser processado para libertar as células por físico (ou seja moído) ou enzimática (ie colagenase) métodos. Figura 1. Desidrataçãoted PVA discos de esponja em três tamanhos diferentes. Figura 2. Imagem do modelo do rato de cicatrização da ferida mostrando a posição de lateral e quatro esponjas de PVA. Figura 3. (A) coloração H & E em 4x e (B) coloração Tricrômico em 10x de esponjas de parafina, seccionados incorporados. Figura 4. (A) Imagem de esponja de corte pela metade ao longo do diâmetro. (B) PVA meia esponja, incorporado lado cortado para baixo em outubro

Discussion

<p class="jove_content"> O modelo de esponja de cicatrização da ferida tem múltiplas variações, que pode ser realizada em muitas espécies diferentes, incluindo os seres humanos e as esponjas pode também ser implantado dorsalmente^1,2,8. Para os estudos em seres humanos e outras espécies, esponjas podem precisar de ser colocado num tubo de silicone poroso para impedir a esponja de ser encapsulados e para permitir a facilidade de remoção^4,8. A localização do implante esponja pode ser alterada com base em resultados desejados e habilidade do técnico. Implante dorsal pode permitir que as esponjas para mover sob a pele, enquanto que os implantes ventrais são mais difíceis devido a probabilidade de corte através da cavidade abdominal. As esponjas pode ser configurado com um cateter de modo a que a entrega da droga é constante e controlada, eliminando a necessidade de injecções múltiplas⁹. Menores, esponjas tubulares pode mesmo ser injectado através de uma agulha⁸. Composição esponjas 'não está limitada a apenas o álcool polivinílico. Eles podem ser preparados a partir de muitos materiais, exclusivamente ou em combinação⁷.</p><p class="jove_content"> É fundamental para a preparação de esponja e colocação no animal para ser consistente e bem compreendida. Se esponjas são cortadas a partir de folhas devem ser de peso semelhante para comparabilidade. Se a esponja é para ser carregado com células ou um tratamento, a quantidade colocada em cada esponja deve ser exacta. O processo de cura pode variar com base na localização da colocação da esponja no animal e cura irá diminuir à medida que a distância a partir dos aumentos de cabeça^1,10.</p>

Materials

Material Name	Company	Catalogue number	Comments
PVA Sponge	Medtronic	CF120	The size and porosity of the sponge depends on the experiment
Scalpel blade size 15	BD Medial	371115
Metzembaum scissors	Thermo Scientific	79-211
Hemostat Forceps	Fine Science Tools	13004-14
Needle holder	Fine Science Tools	12004-16
5-0 nylon suture	Ethilon	698
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583