الطيفية Karyotyping إلى دراسة حالة شذوذ الكروموسومات في البشر والفئران مع مرض الكلى المتعدد الكيسات
Summary
Karyotyping الطيفية (السماء) هو تقنية علم الوراثة الخلوية المتقدمة لتحديد الانحرافات الجينية والكروموسومات. هذه التقنية يستفيد من تحقيقات اللوحة كروموسوم، والتي تسمح بتصنيف جميع الكروموسومات. ويمكن أيضا تحديد الانحرافات SKY كروموسوم معقدة وعيوب فصل في الفئران والبشر يعانون من أمراض مختلفة، بما في ذلك مرض الكلى المتعدد الكيسات.
Abstract
الطريقة التقليدية لتحديد وتصنيف الكروموسومات الفردية يعتمد على نمط فريد من ربط كل كروموسوم في فصيلة محددة يجري تحليلها 1 و 2. هذا الأسلوب الكلاسيكي النطاقات، ولكن، لا يمكن الاعتماد عليها في تحديد التشوهات الكروموسومية معقدة مثل تلك التي ترتبط مع مرض السرطان. للتغلب على القيود المفروضة على تقنية النطاقات، هو عرض Karyotyping الطيفي (السماء) لتوفير معلومات موثوق بها كثيرا عن شذوذ صبغي.
SKY هو مضان متعدد الألوان في الموقع التهجين (FISH) تقنية للكشف عن الصبغيات (الكروموسومات) الطورية مع مجهر طيفي 3 و 4. وقد ثبت السماء ليكون أداة قيمة لتحليل خلوي من مجموعة واسعة من الشذوذ الصبغي المرتبط مع عدد كبير من الأمراض الوراثية والأورام الخبيثة 5 و 6. SKY ينطوي على استخدام مجسات DNA fluorescently متعدد الألوان ذات العلامات أعد من oligonucle المنحطةotide الاشعال بواسطة PCR. وبالتالي، كل كروموسوم لها لون فريد من نوعه بعد الطيفية في الموقع التهجين مع تحقيقات، التي وصفت بشكل مختلف مع خليط من الأصباغ الفلورية (رودامين، تكساس الأحمر، Cy5، FITC وCy5.5). تحقيقات المستخدمة في السماء تتكون من ما يصل الى 55 كروموسوم تحقيقات محددة 7-10.
إجراءات SKY ينطوي على عدة خطوات (الشكل 1). SKY يتطلب توافر الخلايا مع ارتفاع مؤشر الإنقسامية من الأنسجة الطبيعية أو مريضة أو الدم. وتنتشر في الصبغيات (الكروموسومات) من خلية واحدة من الخلايا الأولية إما طازجة أو عزل خط الخلية على شريحة زجاجية. يسمى هذا انتشار كروموسوم مع مجموعة مختلفة من الأصباغ الفلورية معينة لكل كروموسوم. الكشف عن التحقيق والحصول على الصور، ونظام التصوير الطيفي يتكون من تداخل سانياك وكاميرا CCD. وهذا يسمح قياس طيف الضوء المرئي المنبعث من العينة والحصول على صورة طيفية جيئة وذهاباالكروموسومات متر فردي. HiSKY، والبرمجيات المستخدمة لتحليل نتائج الصور التي تم التقاطها، ويوفر سهولة تحديد الشذوذ الصبغي. والنتيجة النهائية هي الطورية وصورة تصنيف النمط النووي، والذي كل زوج من الصبغيات (الكروموسومات) لها لون مميز (الشكل 2). وهذا يسمح سهولة تحديد هويات كروموسوم وtranslocations. لمزيد من المعلومات، يرجى زيارة موقع التصوير الطيفي التطبيقية ( http://www.spectral-imaging.com/ ).
وقد استخدم مؤخرا SKY لتحديد العيوب والتشوهات فصل كروموسوم كروموسوم في البشر والفئران مع مرض وراثي جسمي الكلى المتعدد الكيسات (ADPKD)، وهو مرض وراثي يتميز اختلال وظيفي في أهداب الأولية 11-13. باستخدام هذه التقنية، أثبتنا وجود فصل كروموسوم غير طبيعي وتشوهات صبغية في المرضى الذين يعانون ADPKD ونماذج الماوس 14. المزيد من التحليلات باستخدام SKY ليس فقط سمح لنا لتحديد عدد الكروموسومات والهوية، ولكن أيضا للكشف عن التشوهات الكروموسومية بدقة شديدة التعقيد مثل الحذف كروموسوم وtranslocations (الشكل 2).
Protocol
Discussion
Karyotyping الطيفية (السماء) هو تقنية علم الوراثة الخلوية المستخدمة في دراسة التراكيب الجينية والكروموسومات. هذه التقنية يستفيد من تحقيقات اللوحة كروموسوم، ويتم الحصول على الكشف عن هذه التحقيقات من خلال تداخل سانياك. عملية SKY كاملة تستغرق عادة حوالي أسبوع واحد، وأنها تنط…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
والكتاب أود أن أشكر برايان Muntean، لو شاو، تاكاهاشي ماكي ويمزج بلير للحصول على المساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من قبل جوائز من المعاهد الوطنية للصحة (DK080640) وجامعة توليدو بالحركة وProMedica بحوث جائزة تحفيز للدكتور SURYA Nauli.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| DMEM | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Colcemid | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 μg/ml |
| HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| SKY paint probe kit (Human) | Applied Spectral Imaging | SKY000028 | |
| SKY paint probe kit (Mouse) | Applied Spectral Imaging | SKY000030 | |
| Concentrated antibody detection kit | Applied Spectral Imaging | SKY000033 | |
| Trypsin | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| RNase A | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
| MgCl2 | Fluka | 63069-500ML | |
| 37% Formaldehyde | Mallinckrodt Baker | 2106-02 | |
| 20X SSC | Promega | V4261 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | prepare just before use |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Microscope glass slides | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Rubber cement | Elmer’s (local retail store) | ||
| Hybridization/ humidifiedchamber/Tray | Simport | M920-2 | put wet paper towels at the bottom |
| Thermocycler | Eppendorf | Epgradient S | |
| Shaking platform/Orbital shaker | Bellco Biotechnology | ||
| Shaking/water bath | Precision Scientific | ||
| DAPI filter cube | Chroma Technology | ||
| SKY filter cube | Chroma Technology | ||
| SpectraCube | Applied Spectral Imaging | ||
| Inverted cell culture microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS100 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX70 | 60X oil |
Riferimenti
- Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. Chemical differentiation along metaphase chromosomes. Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).
- Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 2, 971-972 (1971).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).
- Schrock, E., Zschieschang, P., O’Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes–applications for genetic diagnostics and research. Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).
- Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms. Genes, Chromosomes & Cancer. 30, 349-363 (2001).
- Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping. Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).
- Karpf, A. R., Matsui, S. Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells. Ricerca sul cancro. 65, 8635-8639 (2005).
- Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids. Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).
- Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer. Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).
- Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping. Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany). 75, 801-814 (1997).
- AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation Research. 104, 860-869 (2009).
- Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells. Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).
- Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1. Circulation. 117, 1161-1171 (2008).
- AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation. Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).
- Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping. Genes, Chromosomes & Cancer. 25, 53-59 (1999).
