Spectral Karyotyping å studere kromosomfeil i mennesker og mus med polycystisk nyresykdom

Summary

Spectral Karyotyping (SKY) er en avansert cytogenetikk teknikk for å identifisere genomisk og kromosomavvik. Denne teknikken tar nytte av kromosom maleri sonder, som lar klassifisering av alle kromosomer. SKY kan også identifisere komplekse kromosomavvik og segregering mangler i mus og mennesker med ulike sykdommer, inkludert polycystisk nyresykdom.

Abstract

Konvensjonell metode for å identifisere og klassifisere de enkelte kromosomer avhenger unike striper mønster av hvert kromosom i en bestemt art blir analysert ^{1, 2.} Denne klassiske banding teknikk, derimot, er ikke pålitelig i å identifisere komplekse kromosomavvik som de assosiert med kreft. For å overvinne begrensninger av den banding teknikk, Spectral Karyotyping (SKY) innført for å gi mye pålitelig informasjon om kromosomfeil.

SKY er en flerfarget fluorescens in-situ hybridisering (FISH) teknikk for å oppdage Metafasekromosomer med spektral mikroskop ^{3, 4.} SKY har vist seg å være et verdifullt verktøy for cytogenetisk analyse av et bredt spekter av kromosomfeil forbundet med et stort antall genetiske sykdommer og malignitet ^{5, 6.} SKY innebærer bruk av flerfarget fluorescently-merket DNA prober fremstilt fra den degenererte oligonucleotide primere med PCR. Dermed har hver kromosom en unik spektral farge etter in-situ hybridisering med prober, som er ulikt merket med en blanding av fluorescerende fargestoffer (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC og Cy5.5). Sondene brukes til SKY bestå av opptil 55 kromosom spesifikke probene ^7-10.

Prosedyren for SKY involverer flere trinn (figur 1). SKY krever tilgjengelighet av celler med høy mitotisk indeks fra normal eller sykt vev eller blod. Kromosomene i en enkelt celle fra enten en fersk isolert primær celle eller en cellelinje er spredt på en glass-slide. Dette kromosom spredningen er merket med en annen kombinasjon av fluorescerende fargestoffer spesifikke for hvert kromosom. For probe deteksjon og bilde oppkjøpet består spektral avbildning system av sagnac interferometer og en CCD-kamera. Dette gjør måling av det synlige lysspekteret slippes ut fra prøven og å skaffe en spektral bilde from enkelte kromosomer. HiSKY, leverer programvaren som brukes til å analysere resultatene av bildene, en enkel identifisering av kromosom anomalier. Sluttresultatet er en metafase og en karyotype klassifisering bilde, der hver kromosompar har en distinkt farge (figur 2). Dette gir enkel identifisering av kromosom identiteter og translokasjoner. For mer informasjon, vennligst besøk Applied Spectral Imaging nettsted ( http://www.spectral-imaging.com/ ).

SKY ble nylig brukt til en identifisering av kromosom segregering defekter og kromosomfeil hos mennesker og mus med autosomal dominant polycystisk nyresykdom (ADPKD), en genetisk sykdom karakterisert ved dysfunksjon i primær cilia ^11-13. Ved hjelp av denne teknikken, viste vi tilstedeværelse av unormale kromosom segregasjon og kromosomavvik defekter i ADPKD pasienter og musemodeller ¹⁴. Videre analyser ved hjelp av SKY ikke bare tillot oss å identifisere kromosomal antall og identitet, men også til nøyaktig oppdage svært komplekse kromosomavvik som kromosom slettinger og translokasjoner (figur 2).

Protocol

1. Cell forbehandling og metafase forberedelse Cellene er dyrket i Dulbecco sin Endring av Ørns Medium (DMEM) som inneholder 10-15% fosterets storfe serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin ved 37 ° C med 5% CO 2 inkubator, inntil de når 70-80% confluency. Unn cellene med colcemid løsning på 0,05 mikrogram / ml i 30-60 min. Samle medium med eventuelle flytende cellene i 50 ml sterile falcon sentrifugerør. Skyll cellene på tallerkenen med sterile1X-PBS. Etter inkubasjon…

Discussion

Spectral Karyotyping (SKY) er en cytogenetikk teknikk som brukes i å studere genomisk og kromosomal komposisjoner. Denne teknikken tar nytte av kromosom maleri sonder, og påvisning av disse sonder er anskaffet gjennom en sagnac interferometer. Den komplette SKY prosessen tar vanligvis omtrent en uke, og det innebærer flere viktige trinn (figur 1). SKY bruker en standard protokoll, som først ble beskrevet av Padilla-Nash et al ^tre. Protokollen har siden blitt bearbeidet av ulike c…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
DMEM	Cellgro Mediatech Inc.	10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30088-03
Penecillin/Streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
Colcemid	Roche Diagnostics	10 295 892 001	10 μg/ml
HCl	Fisher Scientific	A144-500
KCl	Fisher Scientific	S77375-1
Phosphate buffered saline	Thermo Scientific	SH30256-01
SKY paint probe kit (Human)	Applied Spectral Imaging	SKY000028
SKY paint probe kit (Mouse)	Applied Spectral Imaging	SKY000030
Concentrated antibody detection kit	Applied Spectral Imaging	SKY000033
Trypsin	Thermo Scientific	SH30236.01
Methanol	Fisher Scientific	A433P-4
Acetic acid	Fisher Scientific	A38-212
RNase A	Roche Diagnostics	10 109 169 001
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887-5G
MgCl2	Fluka	63069-500ML
37% Formaldehyde	Mallinckrodt Baker	2106-02
20X SSC	Promega	V4261
Formamide	Fluka	47671	prepare just before use
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Microscope glass slides	Fisher Scientific	12-549
Microscope cover glass 24x60mm	VWR Vista Vision	16004-312
Rubber cement	Elmer’s (local retail store)
Hybridization/ humidifiedchamber/Tray	Simport	M920-2	put wet paper towels at the bottom
Thermocycler	Eppendorf	Epgradient S
Shaking platform/Orbital shaker	Bellco Biotechnology
Shaking/water bath	Precision Scientific
DAPI filter cube	Chroma Technology
SKY filter cube	Chroma Technology
SpectraCube	Applied Spectral Imaging
Inverted cell culture microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS100
Fluorescence microscope	Olympus	IX70	60X oil