Spectral karyotyping til Studieinformationen kromosomfejl hos mennesker og mus med polycystisk nyresygdom

Summary

Spectral karyotyping (SKY) er en avanceret cytogenetik teknik til at identificere genomiske og kromosomforandringer. Denne teknik drager fordel af kromosom maleri prober, hvilket muliggøre klassificering af alle kromosomer. SKY kan også identificere komplekse kromosomafvigelser og adskillelse mangler i mus og mennesker med forskellige sygdomme, herunder polycystisk nyresygdom.

Abstract

Konventionel metode at identificere og klassificere individuelle kromosomer afhænger af den unikke banding mønster af hvert kromosom i en specifikke arter, der analyserede ^{1, 2.} Denne klassiske banding teknik, imidlertid, er ikke er pålidelig i at identificere komplekse kromosomforandringer såsom dem associeret med cancer. For at overvinde de begrænsninger af banding teknik, er Spectral karyotyping (SKY), indført til at give meget pålidelige oplysninger om kromosomfejl.

SKY er en flerfarve fluorescens in-situ hybridisering (FISH) teknik til at detektere metafasekromosomer med spektral mikroskop ^{3, 4.} SKY har vist sig at være et værdifuldt værktøj til cytogenetisk analyse af en bred vifte af kromosom abnormiteter i forbindelse med et stort antal af genetiske sygdomme og maligniteter ^{5, 6.} SKY involverer anvendelsen af ​​flerfarvede fluorescens-mærkede DNA-prober fremstillet ud fra den degenererede oligonucleotide primere ved PCR. Således, hver kromosom har et unikt spektral farve efter in-situ hybridisering med prober, der er differentielt mærket med en blanding af fluorescerende farvestoffer (Rhodamin, Texas Red, Cy5, FITC og Cy5.5). Proberne, der anvendes for SKY bestå af op til 55 kromosomområder specifikke prober ^7-10.

Den Proceduren for SKY involverer flere trin (figur 1). SKY kræver tilgængeligheden af ​​celler med højt mitotisk indeks fra normalt eller sygt væv eller blod. Kromosomerne af en enkelt celle fra enten en frisk isoleret primær celle eller en cellelinie er spredt på et objektglas. Dette kromosom spread er mærket med en forskellig kombination af fluorescerende farvestoffer specifikke for hvert kromosom. Til detektering og image erhvervelse består spektral imaging system sagnac interferometer og et CCD-kamera. Dette tillader måling af det synlige lysspektrum udsendt fra prøven og til at erhverve en spektral billede tilbagem. individuelle kromosomer. HiSKY, den software, der bruges til at analysere resultaterne af de billeder, giver det let at identificere kromosom anomalier. Slutresultatet er en metafase, og en karyotype klassifikation billede, i hvilken hvert par af kromosomer har en distinkt farve (figur 2). Dette giver mulighed for nem identifikation af kromosom identiteter og omplantning. For flere detaljer, kan du besøge Applied Spectral Imaging hjemmeside ( http://www.spectral-imaging.com/ ).

SKY blev for nylig anvendt til en identifikation af kromosom adskillelse fejl og kromosomfejl hos mennesker og mus med autosomal dominant polycystisk nyresygdom (ADPKD), en genetisk sygdom karakteriseret ved dysfunktion i primære cilier ^11-13. Ved at bruge denne teknik, vi viste tilstedeværelsen af unormal kromosom segregering og kromosomfejl i ADPKD patienter og musemodeller ¹⁴. Yderligere analyser anvender SKY ikke kun lov for os at identificere kromosomalt antal og identitet, men også nøjagtigt at detektere meget komplekse kromosomforandringer såsom kromosomområder deletioner og omplantning (figur 2).

Protocol

1. Celle præbehandling og metafase forberedelse Cellerne dyrkes i Dulbeccos Modifikation af Eagle 's Medium (DMEM) indeholdende 10-15% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin ved 37 ° C med 5% CO 2 inkubator, indtil de når 70-80% konfluens. Behandle de cellerne med colcemid opløsning ved 0,05 ug / ml for 30-60 min. Indsamle den medium indeholdende eventuelle flydende celler i 50-ml sterile falk at centrifugerør. Skyl cellerne på pladen med sterile1X-…

Discussion

Spectral karyotyping (SKY) er en cytogenetik teknik, der anvendes i at studere genomiske og kromosom-kompositioner. Denne teknik drager fordel af kromosom maleri prober, og påvisning af disse prober er erhvervet gennem en sagnac interferometer. Den komplette SKY proces tager normalt omkring en uge, og det indebærer flere vigtige skridt (figur 1). Det SKY bruger en standard protokol, som første gang blev beskrevet af Padilla-Nash et al ^3. Protokollen er siden blevet tilpasset af fo…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
DMEM	Cellgro Mediatech Inc.	10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30088-03
Penecillin/Streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
Colcemid	Roche Diagnostics	10 295 892 001	10 μg/ml
HCl	Fisher Scientific	A144-500
KCl	Fisher Scientific	S77375-1
Phosphate buffered saline	Thermo Scientific	SH30256-01
SKY paint probe kit (Human)	Applied Spectral Imaging	SKY000028
SKY paint probe kit (Mouse)	Applied Spectral Imaging	SKY000030
Concentrated antibody detection kit	Applied Spectral Imaging	SKY000033
Trypsin	Thermo Scientific	SH30236.01
Methanol	Fisher Scientific	A433P-4
Acetic acid	Fisher Scientific	A38-212
RNase A	Roche Diagnostics	10 109 169 001
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887-5G
MgCl2	Fluka	63069-500ML
37% Formaldehyde	Mallinckrodt Baker	2106-02
20X SSC	Promega	V4261
Formamide	Fluka	47671	prepare just before use
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Microscope glass slides	Fisher Scientific	12-549
Microscope cover glass 24x60mm	VWR Vista Vision	16004-312
Rubber cement	Elmer’s (local retail store)
Hybridization/ humidifiedchamber/Tray	Simport	M920-2	put wet paper towels at the bottom
Thermocycler	Eppendorf	Epgradient S
Shaking platform/Orbital shaker	Bellco Biotechnology
Shaking/water bath	Precision Scientific
DAPI filter cube	Chroma Technology
SKY filter cube	Chroma Technology
SpectraCube	Applied Spectral Imaging
Inverted cell culture microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS100
Fluorescence microscope	Olympus	IX70	60X oil