Spectral Karyotypering naar chromosoomafwijkingen bij mensen en muizen Studie met polycysteuze nierziekte
Summary
Spectral Karyotypering (SKY) is een geavanceerde cytogenetica techniek om genomische en chromosomale afwijkingen te identificeren. Deze techniek profiteert van chromosoom schilderkunst probes, waarmee indeling van alle chromosomen. SKY kan ook worden aangegeven complexe chromosoomafwijkingen en de segregatie defecten in muizen en mensen met diverse ziekten, waaronder polycystische nierziekte.
Abstract
Conventionele methode om identificeren en classificeren individuele chromosomen afhankelijk van de unieke banding patroon van elk chromosoom in een specifieke soort geanalyseerd 1, 2. Deze klassieke banding techniek is echter niet betrouwbaar in identificeren complexe chromosomale aberraties zoals die in verband met kanker. Om de beperkingen van de strepen techniek te overwinnen, is Spectral Karyotypering (SKY) geïntroduceerd om veel betrouwbare informatie over chromosoomafwijkingen te bieden.
SKY is een meerkleuren fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) techniek om metafase chromosomen te detecteren met spectrale microscoop 3, 4. SKY is bewezen een waardevol instrument voor de cytogenetische analyse van een breed scala van chromosoomafwijkingen geassocieerd met een groot aantal genetische ziekten en maligniteiten 5, 6. SKY betreft het gebruik van veelkleurige fluorescent-gelabelde DNA probes bereid uit de gedegenereerde oligonucleotide primers door PCR. Dus elke chromosoom heeft een unieke spectrale kleur na in-situ hybridisatie met probes, die differentieel gelabeld met een mengsel van fluorescerende kleurstoffen (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC en Cy5.5). De sondes gebruikt voor SKY bestaan uit maximaal 55 chromosoom specifieke probes 7-10.
De procedure voor SKY omvat verschillende stappen (Figuur 1). SKY vereist de beschikbaarheid van cellen met een hoge mitotische index van normaal of zieke weefsel of bloed. De chromosomen van een enkele cel, hetzij bij een vers geïsoleerde primaire cel of een cellijn worden op een glasplaatje. Dit chromosoom spread is gelabeld met een andere combinatie van fluorescerende kleurstoffen specifiek voor elk chromosoom. Voor de probe detectie en beeldacquisitie, de spectrale imaging-systeem bestaat uit Sagnac interferometer en een CCD-camera. Hierdoor kunnen de metingen van het zichtbare licht spectrum uitgezonden uit het monster en om een spectraal beeld fro verwervenm de individuele chromosomen. HiSKY, de software die wordt gebruikt om de resultaten van de opgenomen beelden te analyseren, biedt een gemakkelijke identificatie van chromosoom afwijkingen. Het eindresultaat is een metafaseachtig en een karyotype classificatie beeld, waarin elk paar chromosomen heeft een afzonderlijke kleur (figuur 2). Dit maakt eenvoudige identificatie van chromosoom identiteiten en translocaties. Voor meer informatie kunt u terecht op Toegepaste Spectral Imaging website ( http://www.spectral-imaging.com/ ).
SKY is recentelijk voor een identificatie van chromosoom segregatie gebreken en chromosoom afwijkingen bij mensen en muizen met autosomaal dominante polycystische nierziekte (ADPKD), een genetische ziekte die wordt gekenmerkt door stoornissen in de primaire cilia 11-13. Met behulp van deze techniek hebben we aangetoond dat de aanwezigheid van abnormale chromosoom segregatie en chromosomale afwijkingen bij ADPKD patiënten en muismodellen 14. Verdere analyses gebruik SKY niet alleen ons toegestaan om chromosomale aantal en de identiteit identificeren, maar ook om nauwkeurig te detecteren zeer complexe chromosomale aberraties zoals chromosoom deleties en translocaties (figuur 2).
Protocol
Discussion
Spectral Karyotypering (SKY) is een cytogenetica techniek die gebruikt wordt in het bestuderen van genomische en chromosomale composities. Deze techniek maakt gebruik van chromosoom painting probes, en de detectie van deze probes worden verworven door middel van een Sagnac interferometer. Het complete SKY proces duurt meestal ongeveer een week, en het gaat om een aantal belangrijke stappen (figuur 1). De SKY maakt gebruik van een standaard protocol, die voor het eerst werd beschreven door Padilla-Nash <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs willen Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi en Blair Mell bedanken voor hun technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door prijzen van de NIH (DK080640) en de Universiteit van Toledo & ProMedica Translationeel Onderzoek Stimuleringsprogramma Award uit aan dr. Surya Nauli.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| DMEM | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Colcemid | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 μg/ml |
| HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| SKY paint probe kit (Human) | Applied Spectral Imaging | SKY000028 | |
| SKY paint probe kit (Mouse) | Applied Spectral Imaging | SKY000030 | |
| Concentrated antibody detection kit | Applied Spectral Imaging | SKY000033 | |
| Trypsin | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| RNase A | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
| MgCl2 | Fluka | 63069-500ML | |
| 37% Formaldehyde | Mallinckrodt Baker | 2106-02 | |
| 20X SSC | Promega | V4261 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | prepare just before use |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Microscope glass slides | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Rubber cement | Elmer’s (local retail store) | ||
| Hybridization/ humidifiedchamber/Tray | Simport | M920-2 | put wet paper towels at the bottom |
| Thermocycler | Eppendorf | Epgradient S | |
| Shaking platform/Orbital shaker | Bellco Biotechnology | ||
| Shaking/water bath | Precision Scientific | ||
| DAPI filter cube | Chroma Technology | ||
| SKY filter cube | Chroma Technology | ||
| SpectraCube | Applied Spectral Imaging | ||
| Inverted cell culture microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS100 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX70 | 60X oil |
Riferimenti
- Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. Chemical differentiation along metaphase chromosomes. Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).
- Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 2, 971-972 (1971).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).
- Schrock, E., Zschieschang, P., O’Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes–applications for genetic diagnostics and research. Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).
- Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms. Genes, Chromosomes & Cancer. 30, 349-363 (2001).
- Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping. Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).
- Karpf, A. R., Matsui, S. Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells. Ricerca sul cancro. 65, 8635-8639 (2005).
- Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids. Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).
- Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer. Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).
- Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping. Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany). 75, 801-814 (1997).
- AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation Research. 104, 860-869 (2009).
- Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells. Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).
- Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1. Circulation. 117, 1161-1171 (2008).
- AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation. Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).
- Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping. Genes, Chromosomes & Cancer. 25, 53-59 (1999).
