Spektrale Karyotypisierung zu Chromosomenanomalien in Menschen und Mäusen mit Kidney Disease Study
Summary
Spektrale Karyotypisierung (SKY) ist eine fortgeschrittene Technik, um Zytogenetik genomischen und chromosomalen Aberrationen zu identifizieren. Diese Technik nutzt die Vorteile von Chromosom Malerei Sonden, die es erlauben die Einstufung aller Chromosomen. SKY kann auch identifiziert werden komplexe Chromosomenaberrationen und Segregation Defekte in Mäusen und Menschen mit verschiedenen Krankheiten, einschließlich Zystennieren.
Abstract
Konventionelle Methode zum Identifizieren und Klassifizieren einzelnen Chromosomen hängt von der einzigartigen Bandenmuster jedes Chromosoms einer bestimmten Tierart zu analysierenden 1, 2. Diese klassische Banding-Technik, ist aber nicht bei der Identifizierung von komplexen chromosomalen Aberrationen, wie sie im Zusammenhang mit Krebs zuverlässig. Um die Einschränkungen des Banding-Technik zu überwinden, wird Spektrale Karyotypisierung (SKY) eingeführt, um viel zuverlässige Informationen über Chromosomenanomalien bieten.
SKY ist eine multicolor Fluoreszenz-in-situ Hybridisierung (FISH) Technik, um Metaphasen-Chromosomen mit spektralen Mikroskop 3, 4 zu erfassen. SKY ist nachgewiesen worden, ein wertvolles Werkzeug für die zytogenetische Analyse eines breiten Spektrums von Chromosomenanomalien mit einer großen Anzahl von genetischen Erkrankungen und Malignome 5, 6 verbunden sein. SKY umfasst die Verwendung von Multicolor-fluoreszierend markierten DNA-Sonden aus dem entarteten Oligonucleotid hergestelltotide Primern durch PCR. Somit hat jeder Chromosom einen einzigartigen spektralen Farbe nach in-situ-Hybridisierung mit Sonden, die differentiell mit einem Gemisch von Fluoreszenzfarbstoffen (Rhodamin, Texas Red, Cy5, FITC und Cy5.5) so gekennzeichnet sind. Die Sonden für SKY verwendet werden, bestehen aus bis zu 55 Chromosomen-spezifischen Sonden 10.07.
Das Verfahren für SKY umfasst mehrere Schritte (Abbildung 1). SKY erfordert die Verfügbarkeit von Zellen mit hoher Mitoseindex von normalen oder erkrankten Gewebe oder Blut. Die Chromosomen einer einzelnen Zelle entweder von einem frisch isolierten-Primär-Zelle oder einer Zellinie werden auf einem Glas-Objektträger ausgestrichen. Dieses Chromosom Ausbreitung wird mit einer unterschiedlichen Kombination von Fluoreszenzfarbstoffen spezifisch für jedes Chromosom markiert. Für Sonde Detektion und Bildaufnahme, besteht die Spectral Imaging System der Sagnac-Interferometer und einer CCD-Kamera. Diese erlaubt die Messung der sichtbaren Lichtspektrums von der Probe emittiert und einen spektralen Bild her zu erwerbenm einzelnen Chromosomen. HiSKY, bietet die Software verwendet, um die Ergebnisse der erfassten Bilder zu analysieren, eine leichte Identifizierung von Chromosomenanomalien. Das Endergebnis ist eine Metaphase und ein Karyotyp Klassifizierung Bildes, bei dem jedes Paar von Chromosomen hat eine bestimmte Farbe (Abbildung 2). Dies ermöglicht eine einfache Identifizierung des Chromosoms Identitäten und Translokationen. Für weitere Informationen, besuchen Sie bitte Applied Spectral Imaging Website ( http://www.spectral-imaging.com/ ).
SKY wurde vor kurzem für eine Identifizierung von Chromosomensegregation Mängel und Chromosomenanomalien bei Menschen und Mäusen mit autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD), eine genetische Erkrankung, die durch Funktionsstörungen bei primären Zilien 11-13 gekennzeichnet werden. Mit dieser Technik konnten wir zeigen, das Vorhandensein von abnormen Chromosom Segregation und Chromosomenstörungen in ADPKD Patienten und Mausmodellen 14. Weitere Analysen unter Verwendung SKY nicht nur erlaubt uns, chromosomalen Teilnummer und identifizieren zu identifizieren, sondern auch genau zu erfassen, sehr komplex chromosomalen Abweichungen wie Chromosom Deletionen und Translokationen (Abbildung 2).
Protocol
Discussion
Spektrale Karyotypisierung (SKY) ist eine Technik bei der Untersuchung Zytogenetik genomische und chromosomale Zusammensetzungen verwendet. Diese Technik nutzt die Vorteile von Chromosom Malerei Sonden, und die Detektion dieser Sonden durchstöberst einem Sagnac-Interferometers erfasst. Die komplette SKY Prozess dauert etwa eine Woche, und es sind mehrere wichtige Schritte (Abbildung 1). Die SKY mit einem Standardprotokoll, das zuerst von Padilla-Nash et al 3 beschrieben wurde. Das P…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Autoren möchten sich bei Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi und Blair Mell für ihre technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen von der NIH (DK080640) und der University of Toledo & ProMedica Translational Research Award an Dr. Stimulation Surya Nauli unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| DMEM | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Colcemid | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 μg/ml |
| HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| SKY paint probe kit (Human) | Applied Spectral Imaging | SKY000028 | |
| SKY paint probe kit (Mouse) | Applied Spectral Imaging | SKY000030 | |
| Concentrated antibody detection kit | Applied Spectral Imaging | SKY000033 | |
| Trypsin | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| RNase A | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
| MgCl2 | Fluka | 63069-500ML | |
| 37% Formaldehyde | Mallinckrodt Baker | 2106-02 | |
| 20X SSC | Promega | V4261 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | prepare just before use |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Microscope glass slides | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Rubber cement | Elmer’s (local retail store) | ||
| Hybridization/ humidifiedchamber/Tray | Simport | M920-2 | put wet paper towels at the bottom |
| Thermocycler | Eppendorf | Epgradient S | |
| Shaking platform/Orbital shaker | Bellco Biotechnology | ||
| Shaking/water bath | Precision Scientific | ||
| DAPI filter cube | Chroma Technology | ||
| SKY filter cube | Chroma Technology | ||
| SpectraCube | Applied Spectral Imaging | ||
| Inverted cell culture microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS100 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX70 | 60X oil |
Riferimenti
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