Cariotipo spettrale (SKY) è una tecnica avanzata citogenetica per individuare aberrazioni genomiche e cromosomiche. Questa tecnica si avvale di sonde cromosomiche pittura, che permettono la classificazione di tutti i cromosomi. SKY può anche identificare aberrazioni cromosomiche complesse e difetti segregazione nei topi e nell'uomo con varie patologie, tra cui la malattia del rene policistico.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Cariotipo spettrale allo studio anomalie cromosomiche negli esseri umani e nei topi con malattia del rene policistico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Metodo convenzionale per identificare e classificare i singoli cromosomi dipende dal modello unico bande di ciascun cromosoma in una determinata specie in fase di analisi 1, 2. Questa tecnica classica banding, tuttavia, non è affidabile nell'identificare complesse aberrazioni cromosomiche come quelle associate con il cancro. Per superare i limiti della tecnica banding, cariotipo spettrale (SKY) viene introdotto per fornire molte informazioni affidabili sulle anomalie cromosomiche.
SKY è una fluorescenza multicolor ibridazione in situ (FISH), tecnica per rilevare cromosomi in metafase, con microscopio spettrale 3, 4. SKY ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per l'analisi citogenetica di una vasta gamma di anomalie cromosomiche associate con un gran numero di malattie genetiche e tumori maligni 5, 6. SKY implica l'uso di sonde di DNA multicolor marcato in fluorescenza preparati dal degenerato oligonucleprimers otide mediante PCR. Così, ogni cromosoma ha un colore univoco spettrale dopo in-situ ibridazione con sonde, che sono differenzialmente etichettati con una miscela di coloranti fluorescenti (Rodamina, Texas Red, Cy5, FITC e Cy5.5). Le sonde utilizzate per SKY contenere fino a 55 sonde cromosoma specifiche 7-10.
La procedura per SKY prevede diversi passaggi (Figura 1). SKY richiede la disponibilità di cellule con elevato indice mitotico da tessuto normale o malato o di sangue. I cromosomi di una cellula singola da o una cella isolate di fresco primaria o una linea cellulare sono diffuse su un vetrino. Questo spread cromosoma è etichettato con una diversa combinazione di coloranti fluorescenti specifici per ciascun cromosoma. Per il rilevamento sonda e acquisizione delle immagini, il sistema di imaging spettrale consiste di interferometro Sagnac e una telecamera CCD. Questo permette misurazione dello spettro di luce visibile emessa dal campione e di acquisire una immagine spettrale frocromosomi m individuali. HiSKY, il software utilizzato per analizzare i risultati delle immagini catturate, fornisce una facile identificazione di anomalie cromosomiche. Il risultato finale è uno metafase e una immagine classificazione cariotipo, in cui ciascuna coppia di cromosomi ha un colore distinto (Figura 2). Questo permette una facile identificazione delle identità e le traslocazioni cromosomiche. Per ulteriori informazioni, visitare il sito Applied Spectral Imaging ( http://www.spectral-imaging.com/ ).
SKY è stato recentemente utilizzato per l'identificazione di difetti segregazione dei cromosomi e le anomalie cromosomiche negli esseri umani e nei topi con malattia autosomica dominante del rene policistico (ADPKD), una malattia genetica caratterizzata da una disfunzione in cilia primaria 11-13. Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato la presenza di segregazione dei cromosomi anormali e difetti cromosomici in pazienti ADPKD e modelli di topo 14. Ulteriori analisi basate SKY non solo ci ha permesso di identificare il numero cromosomico e identità, ma anche per rilevare con precisione le aberrazioni cromosomiche molto complessi come le delezioni e le traslocazioni cromosomiche (Figura 2).
Protocollo
1. Cella pretrattamento e la preparazione metafase
- Le cellule sono cresciute in modif Dulbeccòs di Medio di Eagle (DMEM) contenente 10-15% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina / streptomicina a 37 ° C con 5% CO 2 incubatore, fino a raggiungere 70-80% confluenza.
- Trattare le cellule con soluzione Colcemid a 0,05 ug / ml per 30-60 min.
- Raccogliere il terreno contenente le cellule galleggianti da 50 ml sterili provette Falcon. Lavare le cellule sulla piastra con sterile1X-PBS. Dopo aver incubato con tripsina sterile per 1-2 min, raccolto e raccogliere le cellule rimanenti nel tubo stesso.
- Centrifugare le provette....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Cariotipo spettrale (SKY) è una tecnica utilizzata nello studio di citogenetica composizioni genomiche e cromosomiche. Questa tecnica si avvale di sonde cromosoma pittura, e il rilevamento di queste sonde sono stati acquisiti tramite un interferometro di Sagnac. Il processo di SKY completo dura di solito circa una settimana, e coinvolge diversi passaggi chiave (Figura 1). La SKY utilizza un protocollo standard, che è stato descritto da Padilla-Nash et al 3. Il protocollo è stato poi .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi e Blair Mell per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da premi dal NIH (DK080640) e The University of Translational Research Award stimolazione Toledo & Promedica al dottor Surya Nauli.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| DMEM | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Siero bovino fetale (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin / streptomicina | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Colcemid | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 pg / ml |
| HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
| Fosfato soluzione salina tamponata | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| SKY paint kit sonda (Human) | Applicata Imaging Spectral | SKY000028 | |
| SKY vernice sonda kit (mouse) | Applicata Imaging Spectral | SKY000030 | |
| Concentrato kit per il rilevamento degli anticorpi | Applicata Imaging Spectral | SKY000033 | |
| Tripsina | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
| Metanolo | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Acido acetico | Fisher Scientific | A38-212 | |
| RNasi A | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
| Pepsina | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
| MgCl 2 | Fluka | 63069-500ML | |
| 37% Formaldeide | Mallinckrodt Baker | 2106-02 | |
| 20X SSC | Promega | V4261 | |
| Formammide | Fluka | 47671 | Preparare al momento dell'uso |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Microscopio diapositive di vetro | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Microscopio copertura in vetro 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mastice | Elmer (locali negozio al dettaglio) | ||
| Ibridizzazione / humidifiedchamber / Tray | Simport | M920-2 | mettere gli asciugamani di carta bagnati in fondo |
| Thermocycler | Eppendorf | Epgradient S | |
| Scuotendo la piattaforma / Agitatore orbitale | Bellco Biotecnologie | ||
| Scuotendo bagno / acqua | Rigore scientifico | ||
| DAPI filtro cubo | Tecnologia Chroma | ||
| SKY filtro cubo | Tecnologia Chroma | ||
| SpectraCube | Applicata Imaging Spectral | ||
| Inverted cella microscopio cultura | Nikon | Nikon Eclipse TS100 | |
| Microscopio a fluorescenza | Olimpo | IX70 | Olio 60X |
Riferimenti
- Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. Chemical differentiation along metaphase chromosomes. Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).
- Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 2
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
