多発性嚢胞腎疾患で、ヒトとマウスの染色体異常を研究するためにスペクトル核型分析
Summary
スペクトル核型分析（SKY）は、ゲノムと染色体異常を識別するための高度な細胞遺伝学的手法です。この手法は、すべての染色体の分類を可能にする染色体ペインティングプローブ、を利用しています。 SKYはまた、多発性嚢胞腎疾患を含む様々な疾患を持つマウスとヒトの複雑な染色体異常や偏析欠陥を識別することができます。
Abstract
識別し、個々の染色体を分類する従来の方法は、1、2を分析している特定の種の各染色体のユニークなバンドパターンに依存しています。この古典的なバンディング技術は、しかし、そのような癌に関連付けられているような複雑な染色体異常を識別するのに信頼できるものではありません。バンディング技術の限界を克服するために、スペクトル核型分析（SKY）は、染色体異常に多くの信頼できる情報を提供するために導入されています。
SKYは、スペクトル顕微鏡3、4と中期染色体を検出するために多色蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）テクニックです。 SKYは、遺伝的疾患や悪性腫瘍5、6の大規模な番号に関連付けられている染色体異常の広い範囲の細胞遺伝学的分析のための貴重なツールであることが実証されています。 SKYは、縮退oligonucleから調製された多色蛍光標識DNAプローブの使用を含むPCR法によるotideプライマー。したがって、すべての染色体は差蛍光染料（ローダミン、テキサスレッド、Cy5で、FITC及びCy5.5）の混合物で標識されたプローブとのin situハイブリダイゼーション後のユニークなスペクトル色を持っています。 SKYに使用されるプローブは、7月10日 55染色体特異的プローブまでで構成されています。
SKYの手順は、いくつかの手順を実行します（ 図1）が含まれます。 SKYは、正常または病気の組織や血液から高い分裂指数と細胞の可用性を必要とします。新たに単離した初代培養細胞または細胞株のいずれかから単一細胞の染色体は、ガラススライド上に広がっています。この染色体の広がりは、各染色体の特定の蛍光色素の異なる組み合わせで標識されている。プローブ検出と画像取得のために、スペクトルイメージングシステムは、サニャック干渉計とCCDカメラで構成されています。これは、サンプルから発せられる可視光スペクトルの測定を可能にし、あちこちスペクトル画像を取得するメートル、個々の染色体。 HiSKY、撮影した画像の結果を分析するために使用されるソフトウェアは、染色体異常の簡単な識別を提供しています。最終結果は、中期染色体の各ペアは、異なる色（ 図2）を有する核型分類のイメージです。これは染色体のアイデンティティと転座を簡単に識別することができます。詳細については、適用されるスペクトルイメージングのWebサイト（参照してくださいhttp://www.spectral-imaging.com/ ）。
SKYは、最近、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ADPKD）、一次繊毛11-13の機能不全を特徴とする遺伝性疾患とヒトとマウスの染色体の分離の欠陥と染色体異常の同定に使用されていました。このテクニックを使用して、我々は異常な染色体の分離とADPKD患者およびマウスモデル14の染色体の欠陥の存在を実証。 SKYを使用して更なる分析は、私たちは、染色体数とIDを識別するためだけでなく、正確にそのような染色体欠失と転（ 図2）のような非常に複雑な染色体異常を検出することはできませんだけ。
Protocol
Discussion
スペクトル核型分析（SKY）は、ゲノムと染色体の組成を研究に使用される細胞遺伝学手法です。この手法では、染色体彩色プローブを活用し、これらのプローブの検出は、サニャック干渉計を介して取得されます。完全SKYプロセスは、通常1週間程度かかり、それはいくつかの重要なステップ（ 図1）が含まれます。 SKYは、最初のパディリャ、ナッシュら 3によって…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は彼らの技術支援のためにブライアンMuntean、シャオ·ロー、マキ高橋ブレアメルに感謝します。この作品は、NIH（DK080640）とDr。スーリヤNauliにトレド＆ProMedicaトランスレーショナルリサーチ刺激のための賞の大学からの賞によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| DMEM | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Colcemid | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 μg/ml |
| HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| SKY paint probe kit (Human) | Applied Spectral Imaging | SKY000028 | |
| SKY paint probe kit (Mouse) | Applied Spectral Imaging | SKY000030 | |
| Concentrated antibody detection kit | Applied Spectral Imaging | SKY000033 | |
| Trypsin | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| RNase A | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
| MgCl2 | Fluka | 63069-500ML | |
| 37% Formaldehyde | Mallinckrodt Baker | 2106-02 | |
| 20X SSC | Promega | V4261 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | prepare just before use |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Microscope glass slides | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Rubber cement | Elmer’s (local retail store) | ||
| Hybridization/ humidifiedchamber/Tray | Simport | M920-2 | put wet paper towels at the bottom |
| Thermocycler | Eppendorf | Epgradient S | |
| Shaking platform/Orbital shaker | Bellco Biotechnology | ||
| Shaking/water bath | Precision Scientific | ||
| DAPI filter cube | Chroma Technology | ||
| SKY filter cube | Chroma Technology | ||
| SpectraCube | Applied Spectral Imaging | ||
| Inverted cell culture microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS100 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX70 | 60X oil |
Riferimenti
- Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. Chemical differentiation along metaphase chromosomes. Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).
- Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 2, 971-972 (1971).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).
- Schrock, E., Zschieschang, P., O’Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes–applications for genetic diagnostics and research. Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).
- Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms. Genes, Chromosomes & Cancer. 30, 349-363 (2001).
- Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping. Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).
- Karpf, A. R., Matsui, S. Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells. Ricerca sul cancro. 65, 8635-8639 (2005).
- Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids. Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).
- Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer. Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).
- Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping. Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany). 75, 801-814 (1997).
- AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation Research. 104, 860-869 (2009).
- Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells. Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).
- Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1. Circulation. 117, 1161-1171 (2008).
- AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation. Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).
- Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping. Genes, Chromosomes & Cancer. 25, 53-59 (1999).
