Cariotipo espectral para el Estudio de anomalías cromosómicas en humanos y ratones con la enfermedad renal poliquística
Summary
Cariotipo espectral (SKY) es una técnica de citogenética avanzada para identificar aberraciones genómicas y cromosómicas. Esta técnica se aprovecha de las sondas de pintado cromosómico, lo que permite la clasificación de todos los cromosomas. Sky también puede identificar aberraciones cromosómicas y defectos complejos de segregación en ratones y seres humanos con diversas enfermedades, incluyendo enfermedad renal poliquística.
Abstract
El método convencional para identificar y clasificar los cromosomas individuales depende del patrón único de bandas de cada cromosoma en una especie en particular se analizaron 1, 2. Esta técnica clásica anillamiento, sin embargo, no es fiable en la identificación de complejos aberraciones cromosómicas tales como aquellas asociadas con el cáncer. Para superar las limitaciones de la técnica de bandeo, cariotipo espectral (SKY) se introdujo para proporcionar mayor cantidad de información fiable sobre las anomalías cromosómicas.
SKY es una fluorescencia multicolor de hibridación di situ (FISH) para detectar los cromosomas en metafase con el microscopio espectral de 3, 4. SKY ha sido demostrado ser una herramienta valiosa para el análisis citogenético de una amplia gama de anomalías cromosómicas asociadas con un gran número de enfermedades genéticas y enfermedades malignas 5, 6. CIELO implica el uso de sondas de ADN multicolores fluorescentemente-etiquetados preparados a partir de la oligonucleótidos degeneradoscebadores otide por PCR. Así, cada cromosoma tiene un color único espectral después de hibridación di situ con sondas, que están diferencialmente etiquetados con una mezcla de tintes fluorescentes (Rodamina, Texas Red, Cy5, FITC y Cy5.5). Las sondas utilizadas para SKY constar de hasta 55 sondas cromosómicas específicas 7-10.
El procedimiento para SKY implica varios pasos (Figura 1). CIELO requiere la disponibilidad de células con alto índice mitótico a partir de tejido normal o enferma o sangre. Los cromosomas de una sola célula a partir de ya sea un celular recién aisladas primaria o una línea celular se extienden sobre un portaobjetos de vidrio. Esta propagación cromosoma está etiquetado con una combinación diferente de tintes fluorescentes específicas para cada cromosoma. Para la detección de la sonda y la adquisición de imágenes, el sistema de imagen espectral consta de interferómetro de Sagnac y una cámara CCD. Esto permite la medición del espectro de luz visible emitida desde la muestra y para adquirir una imagen espectral vaivénm individuales cromosomas. HiSKY, el software utilizado para analizar los resultados de las imágenes capturadas, proporciona una fácil identificación de anomalías cromosómicas. El resultado final es una metafase y una imagen de clasificación cariotipo, en el que cada par de cromosomas tiene un color distinto (Figura 2). Esto permite una fácil identificación de las identidades cromosoma y translocaciones. Para más información, visite el sitio web Aplicada Spectral Imaging ( http://www.spectral-imaging.com/ ).
SKY se utilizó recientemente para la identificación de los defectos de la segregación cromosómica y las anomalías cromosómicas en humanos y ratones con autosómica dominante renal poliquística (PQRAD), una enfermedad genética que se caracteriza por una disfunción en los cilios primarios 11-13. Usando esta técnica, hemos demostrado la presencia de la segregación cromosómica anormal y anomalías cromosómicas en pacientes PQRAD y modelos de ratón 14. Los análisis adicionales utilizando SKY no sólo nos permitió identificar el número cromosómico y la identidad, sino también para detectar con precisión las aberraciones cromosómicas muy complejas, tales como deleciones y translocaciones cromosómicas (Figura 2).
Protocol
Discussion
Cariotipo espectral (SKY) es una técnica de citogenética utilizada en el estudio de las composiciones genómicas y cromosómicas. Esta técnica se aprovecha de las sondas de pintado cromosómico, y la detección de estas sondas son adquiridos a través de un interferómetro de Sagnac. El proceso de SKY completa generalmente toma alrededor de una semana, e implica varios pasos clave (Figura 1). El SKY utiliza un protocolo estándar, el cual fue descrito por primera vez por Padilla-Nash et al <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Brian Muntean, Lo Shao, Maki Takahashi y Mell Blair por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por concesiones del NIH (DK080640) y la Universidad de Toledo y ProMedica traslacional Premio Estímulo de Investigación con el Dr. Surya Nauli.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| DMEM | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Colcemid | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 μg/ml |
| HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| SKY paint probe kit (Human) | Applied Spectral Imaging | SKY000028 | |
| SKY paint probe kit (Mouse) | Applied Spectral Imaging | SKY000030 | |
| Concentrated antibody detection kit | Applied Spectral Imaging | SKY000033 | |
| Trypsin | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| RNase A | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
| MgCl2 | Fluka | 63069-500ML | |
| 37% Formaldehyde | Mallinckrodt Baker | 2106-02 | |
| 20X SSC | Promega | V4261 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | prepare just before use |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Microscope glass slides | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Rubber cement | Elmer’s (local retail store) | ||
| Hybridization/ humidifiedchamber/Tray | Simport | M920-2 | put wet paper towels at the bottom |
| Thermocycler | Eppendorf | Epgradient S | |
| Shaking platform/Orbital shaker | Bellco Biotechnology | ||
| Shaking/water bath | Precision Scientific | ||
| DAPI filter cube | Chroma Technology | ||
| SKY filter cube | Chroma Technology | ||
| SpectraCube | Applied Spectral Imaging | ||
| Inverted cell culture microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS100 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX70 | 60X oil |
Riferimenti
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