आयनों का पृथक्करण और न्यूक्लिक एसिड के शोधन के लिए पर चिप Isotachophoresis
Summary
(आईटीपी) isotachophoresis एक मजबूत electrokinetic और विष का पता लगाने से नमूना तैयार करने के लिए आवेदन लेकर साथ preconcentration तकनीक अलग है. जुदाई और छोटे अणुओं और सेल संस्कृति lysate से nucleic एसिड के शुद्धिकरण का पता लगाने: हम आईटीपी की शारीरिक सिद्धांतों और दो विशिष्ट उदाहरण के अनुप्रयोगों के लिए इस तकनीक को लागू करने की कार्यप्रणाली की समीक्षा.
Abstract
Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the “ITP interface”). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: “peak” and “plateau” modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.
Protocol
Discussion
आईटीपी तरीकों प्रस्तुत यहाँ तेजी से, संवेदनशील, और मजबूत और ईओण अणुओं का पता लगाने से निपटने के लिए सक्षम. आईटीपी का उपयोग करने में मुख्य चुनौती ले और ते बफ़र्स का उचित विकल्प है. Anionic आईटीपी में, हम आम तौर पर अग्रणी आयनों के रूप में क्लोराइड चुन क्योंकि यह बहुत उच्च पूर्ण गतिशीलता के साथ एक मजबूत एसिड है और इस प्रकार बहुत उम्मीद के मुताबिक गुण है. इसलिए, ऋणयानी आईटीपी में बफर पसंद आमतौर पर एक उचित ते और counterion के चुनने के लिए कम है. चयनात्मक ध्यान केंद्रित प्रयोगों के लिए, ते पसंद contaminating के आयनों का बहिष्कार करने के लिए महत्वपूर्ण है. अनुप्रयोगों में जहां contaminants के मौजूद नहीं हैं, कम ते प्रभावी गतिशीलता ध्यान केंद्रित की तेज दर की ओर जाता है. हम निम्नलिखित का उपयोग करने की सलाह देते हैं, अपेक्षाकृत ते आयनों ऋणयानी अच्छी तरह से व्यवहार किया: एम ई एस, mops, HEPES, tricine है. Counterion की पसंद दोनों प्रणाली और पीएच ते प्रभावी गतिशीलता को प्रभावित करता है. आम counterions (8.1 PKA) tris और बीआईएस tris (6.4 PKA) हैं. कम या उच्च पीएच की आवश्यकता assays के लिए, हम अनुशंसा करते पिरिडीन (5.25 pKa)(9.5 PKA) क्रमशः ethanolamine. टेबल्स 1 और 2 में, ऋणयानी और cationic आईटीपी के लिए, क्रमशः, हम कई उपयोगी बफर उदाहरण संक्षेप. हम एचसीएल ऋणयानी ले और cationic ले आयन के रूप में आयन और सोडियम के रूप में लेते हैं, और हम ले बफर के 100 मिमी ईओण शक्ति मान.
पाठक ध्यान दें कि हमारे प्रोटोकॉल में बफर ईओण शक्ति (और 1-2 तालिकाओं में) हमेशा से अधिक या 10 मिमी के बराबर है. जबकि सिद्धांत में आईटीपी की भौतिकी ईओण 10 मिमी से कम शक्ति पर लागू होता है, 1 मिमी स्तर (उदाहरण के लिए पानी और वातावरण में कार्बन डाइऑक्साइड के बीच प्रतिक्रिया से कार्बोनिक एसिड) के पास प्राकृतिक contaminants अक्सर कम ईओण ताकत buffers के व्यावहारिक उपयोग की सीमा.
हम ध्यान दें कि संकेत पारगमन तंत्र इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत assays के लिए सीमित नहीं है. 5 पठार क्षेत्र शुद्ध मोड में भाग के रूप में संक्षिप्त चर्चा स्थानीय चालकता में परिवर्तन, यूवी absor के माध्यम से पता लगाया जा सकता हैbance, तापमान, अपवर्तन के सूचकांक या. हमारे अपने समूह में, हम एक विधि है जो पता लगाने और अज्ञात analytes की पहचान संवेदनशील के लिए इस्तेमाल फ्लोरोसेंट वाहक ampholytes विकसित किया है 5 शिखर मोड प्रयोगों में, विशेष जांच करने के लिए ध्यान केंद्रित analytes लेबल इस्तेमाल किया जा सकता है. Oligonucleotide जांच संकरण पर अपने लक्ष्य अनुक्रम प्रतिदीप्ति – एक उदाहरण में, हम आणविक बीकन के उपयोग उच्च विशिष्टता के साथ लक्ष्य डीएनए या शाही सेना अणु का पता लगाने के 11,18.
आईटीपी दबाव संचालित प्रवाह और उपनाम की वजह से फैलाव के लिए अपेक्षाकृत मजबूत है, अत्यधिक EOF आईटीपी इंटरफेस है, जहां मतलब EOF वेग आईटीपी वेग के बराबर हो जाता है के ठहराव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं 14 ऐसे मजबूत EOF. विशेष रूप से उच्च पीएच की शर्तों में होता है और कम ईओण ताकत. इस कारण से, हम अगर सुविधाजनक 100 मिमी के आदेश पर 8 या कम पीएच के साथ और ईओण शक्ति के साथ buffers के उपयोग की सलाह देते हैं. हमारे अनुभव में, PVP, borosilicate चिप्स में EOF दमन के लिए सबसे प्रभावी कोटिंग. हालांकि, उसके sieving गुण की वजह से, PVP जीनोमिक डीएनए ध्यान केंद्रित के रूप में कुछ अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है. प्रयोगों में, हम निरीक्षण PVP की कि इसके अलावा बहुत जीनोमिक डीएनए पूर्ण गतिशीलता को कम कर सकते हैं (इस मुद्दे पर जहां यह ध्यान केंद्रित नहीं करता है). इन मामलों में जैसे एक surfactant (जैसे ट्राइटन 100 एक्स) के साथ conjuction में Sigmacote silanol कोटिंग भी EOF को कम करने में प्रभावी हो सकता है 10.
| ते आयनों (-1 PKA) | ||||
| बफरन counterion (1 PKA) | एमईएस (6.10) | MOPS (7.20) | HEPES (7.50) | tricine (8.15) |
| ethanolamine (9.50) | 21.41 | 20.40 | 17.38 | 22.85 |
| Tris (८.०८) | 21.00 | 19.23 </ P> | 15.84 | 17.56 |
| बीआईएस tris (6.40) | 18.22 | 10.41 | 7.30 | 5.23 |
| पिरिडीन (5.18) | 1.01 | 3.72 | 2.42 | 1.48 |
तालिका 1. Anionic आईटीपी में समायोजित शुद्ध analyte क्षेत्र जहाँ ले 100 मिमी एचसीएल और 200 मिमी बफरिंग counterion के प्रभावी गतिशीलता परिमाण (× 10 -9 m 2 / / वी).
| ते कटियन (1 PKA) | ||||
| बफरन counterion (-1 PKA) | ethanolamine (9.50) | Tris (८.०८) | बीआईएस tris (6.40) | पिरिडीन (5.18) |
| एमईएस (6.10) | 35.57 | 21.96 | 16.39 | 10.45 |
| एमओपी एस (7.20) | 35.47 | 20.92 | 9.76 | 3.93 |
| HEPES (7.50) | 35.35 | 19.97 | 7.77 | 2.88 |
| Tricine (8.15) | 34.77 | 16.72 | 4.50 | 1.44 |
तालिका 2 धनायनित आईटीपी में समायोजित शुद्ध analyte क्षेत्र के प्रभावी गतिशीलता (× 10 -9 m 2 / वी /) परिमाण जहां ले 100 मिमी सोडियम और 200 मिमी बफरिंग counterion है.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृतज्ञता के DARPA द्वारा प्रायोजित माइक्रो / नैनो Fluidics बुनियादी बातों फोकस (MF3) अनुबंध संख्या N66001-10-1-4003, के तहत केंद्र से धन और DARPA के N660001-09-सी – +२०८२ के अनुदान से स्वीकार करते हैं.
Materials
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| Distilled water | GIBCO | 10977 | RNase/DNase free |
| Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt | 7708 | |
| hydrochloric acid (HCl) | EMD Chemicals | HX0603-4 | |
| Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
| tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
| bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| EDTA | GIBCO | AM9260G | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
| ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
| Rhodamine 6G | Acros Organics (Geel, Belgium) | CAS 989-38-8 | |
| L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
| Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
| EQUIPMENT | |||
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences Inc. | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
| Vacuum pump | Gast | DOA-P104-AA | |
| Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
| Inverted epifluorescent microscope | Olympus | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
| Filter cube | Omega | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
| Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5 mL capacity |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417C | |
Table 3. Specific reagents and equipment.
Riferimenti
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