פרוטאז וחומצת קטליזאטור זרימות עבודת תיוג המעסיק<sup> 18</supמים> O-מועשר
Summary
זרימות עבודת תיוג איזוטופים יציבות המעסיקות<sup> 18</sup> O מועשר במים (ליאו זרימות עבודה) הם כלים מגוונים ללימודי proteomics כמותיים ואיכותיים. בתהליכי עבודה בסיוע פרוטאז (Paleo),<sup> 18</sup> O-אטומים הם הציגו על ידי מחשוף פרוטאוליטי ותגובות חליפי חמצן carboxyl מתווך על ידי פרוטאזות. בחומצת קטליזאטור זרימת העבודה (Aleo),<sup> 18</sup> O-אטומים הם הציגו על ידי חילופי החמצן carboxyl ב-pH הנמוך.
Abstract
איזוטופים יציבים הם כלים חיוניים בספקטרומטריית מסה ביולוגית. מבחינה הסטורית, 18 איזוטופים יציבים O-נעשו שימוש הנרחב כדי ללמוד את המנגנונים קטליטי של אנזימים פרוטאוליטים 1-3. עם כניסתו של פרוטאומיקה המונית ספקטרומטריית מבוססת, התאגדות enzymatically-הקטליזאטור של 18 O-אטומים ממים יציבים מועשרים isotopically הפכה שיטה פופולרית כמותית להשוות את רמת ביטוי חלבון (נבדק על ידי Fenselau ויאו 4, מיאגי וRao 5 ו יה et al. 6). 18 O-התיוג מהווה חלופה פשוטה וזולה לחומרים כימיים (למשל iTRAQ, ICAT) ו( למשל SILAC) טכניקות תיוג מטבוליות 7. בהתאם לפרוטאז המנוצל, 18 O-תיוג יכול לגרום להתאגדות של עד שני 18 O-אטומים בקבוצת carboxyl C-המסוף של מוצר המחשוף 3 </sup>. תגובת התיוג נחלקת לשני תהליכים עצמאיים, ביקוע האג"ח פפטיד ותגובת חילופי חמצן carboxyl 8. בPaleo (עמ rotease-דואר abeling l ssisted mploying 18 הו מים מועשרים) הסתגלות של O-תיוג האנזימטית 18, שנוצלו 50% 18 הו מים מועשרים להניב חתימות איזוטופ ייחודיות. בשילוב עם רזולוציה גבוהה מטריצה בסיוע יינון desorption ליזר זמן של טיסת טנדם ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF/TOF MS / MS), את מעטפות איזוטופ אופייניות יכול לשמש כדי לזהות מוצרי ביקוע עם רמה גבוהה של פירוט. קודם לכן יש לנו להשתמש Paleo-המתודולוגיה כדי לזהות ולאפיין פרוטאזות אנדוגניים 9 ולנטר תגובות proteolytic 10-11. מאז Paleo מקודד את עצם מהותה של תגובת ביקוע פרוטאוליטי, ההתקנה הניסיונית היא enri פשוט וביוכימייםצעדי chment של מוצרי ביקוע ניתן לעקוף. Paleo-השיטה ניתן להרחיב בקלות ל( i) ניסויים כמובן הזמן שמפקחים על הדינמיקה של תגובות ביקוע proteolytic ו (ב) ניתוח של proteolysis בדגימות ביולוגיות מורכבות המייצגות את התנאים פיסיולוגיים. ניסויי Paleo-TimeCourse לעזור זיהוי צעדים מגבילי קצב עיבוד ביניים תגובה בתגובות מסלול proteolytic מורכבות. יתר על כן, Paleo-התגובה מאפשרת לנו לזהות אנזימים פרוטאוליטים כגון טריפסין פרוטאז סרין, כי הוא מסוגל ליחבוש את מוצרי הביקוע ולזרז את ההתאגדות של 18 2 O-Atom. "תיוג כפול" אנזימים כאלה יכולים לשמש לpostdigestion 18 O-תיוג, שבפפטידים מסומנים באופן בלעדי על ידי תגובת חילופי חמצן carboxyl. האסטרטגיה השלישית שלנו משתרעת תיוג מעסיק 18 הו מים מועשרים מעבר אנזימים ומשתמשת בתנאי pH חומצי להציג סימן איזוטופ יציב O-18atures לפפטידים.
Protocol
Representative Results
Discussion
על ידי שילוב של תיוג איזוטופ יציב וספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה באופן הזמן נפתר, שיטת Paleo-TimeCourse מאפשרת לניתוח דינמי של הדור של מוצרי פפטיד. הבדיקה יכולה לשמש ליצירת פפטידים שכותרת isotopically יציבים ללימודי proteomics כמותיים ואיכותיים ולהעריך את הקינטיקה של פפטידים שprot…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCR גרנט 1R01DE019796.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue number |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX |
Table 1. Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 |
Table 2. Reagents
Riferimenti
- Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
- Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
- Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
- Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
- Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
- Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
- Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
- Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
- Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
- Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156 (2009).
- Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
- Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application “ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
- Qian, W. -. J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
- Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
- Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
- Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid ‘de novo’ peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
- Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
- Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).
