도입 단백 분해 효소와 산 촉매 라벨링 워크 플로<sup> 18</sup> O 강화 물
Summary
채용 안정 동위 원소 라벨 작업 흐름<sup> 18</sup> O 강화 물 (LEO-워크 플로)는 양적 및 질적 단백질 체학 연구를위한 다양한 도구입니다. (PALeO) 단백 분해 효소를 이용한 워크 플로우에서,<sup> 18</sup> O-원자는 프로테아제에 의해 중재 proteolytic 절단 및 카르 복실 산소 교환 반응에 의해 소개되어 있습니다. 산 – 촉매 (ALeO) 워크 플로우에서,<sup> 18</sup> O-원자는 낮은 산도의 카르 복실 산소 교환에 의해 소개되어 있습니다.
Abstract
안정 동위 원소는 생물 질량 분광법에 필수적인 도구입니다. 역사적으로, 18 O-안정 동위 원소는 광범위 1-3 proteolytic 효소의 촉매 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다. 대량 분석법 기반의 단백질 체학의 출현, 안정적 isotopically 풍부한 물 18 O-원자의 효소 – 촉매 결합은 양적 단백질 표현 수준을 (Fenselau 야오 4, 미야기와 라오 5 너희의 검토를 비교하는 인기있는 방법이되었다 외. 6). 18 O-라벨은 화학에 간단하고 저렴한 비용으로 대체 (예 : iTRAQ, ICAT)과 대사 (예 : SILAC) 분류 기술 7 간주됩니다. 활용 단백 분해 효소에 따라 18 O-라벨은 절단 제품 (3)의 C-터미널 카르 복실 그룹에 두 개의 18 O-원자까지의 설립 될 수 </sup>. 라벨 반응은 두 개의 독립적 인 프로세스, 펩타이드 결합 절단과 카르 복실 산소 교환 반응 8로 세분화 할 수 있습니다. 우리의 PALeO (P rotease-18 O-강화 물을 mploying ssisted 난 abeling 전자) 효소 18 O-라벨의 적응, 우리는 독특한 동위 원소의 서명을 얻을을 50 % 18 O-농축 물을 활용. 고해상도와 함께 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화이 시간은 – 비행의 탠덤 질량 분석법 (MALDI-TOF/TOF MS / MS), 특성 동위 원소의 봉투 특이성의 높은 수준의 절단 제품을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이전에 proteolytic 반응 할 10-11을 감지하고 특성화 내생 프로테아제를 9 모니터링 할 수 PALeO-방법론을 사용했습니다. PALeO는 proteolytic 절단 반응의 매우 본질을 인코딩 때문에, 실험 설정은 간단하고 생화학 enri입니다절단 제품의 chment 단계를 피할 수 있습니다. PALeO 방식을 쉽게 proteolytic 절단 반응의 역학 및 생리 조건을 나타내는 복잡한 생물 표본의 proteolysis의 (II) 분석을 모니터링은 (i) 시간 코스 실험로 확장 할 수 있습니다. PALeO – TimeCourse 실험은 복잡한 proteolytic 경로 반응의 속도 – 제한 처리 단계 및 반응 중간체를 식별하는 데 도움이됩니다. 또한, PALeO 반응은 우리가 이러한 자사의 절단 제품을 rebind 및 제 18 O-원자의 결합을 catalyze 할 수있는 세린 프로테아제 트립신과 같은 proteolytic 효소를 식별 할 수 있습니다. 이러한 '이중 라벨'효소 postdigestion 18 펩티드가 독점적 카르 복실 산소 교환 반응에 의해 표시되는 O-라벨, 사용할 수 있습니다. 세 번째 전략은 효소 이상 18 O-농축 물을 고용 라벨 연장 18 O-안정 동위 원소 기호를 소개 산성 pH의 조건을 사용하여펩티드에 atures.
Protocol
Representative Results
Discussion
안정 동위 원소 라벨과 시간이 해결 방법으로 고해상도 질량 분광법을 결합하여 PALeO-TimeCourse 방법은 펩타이드 제품의 세대의 동적 분석을 할 수 있습니다. 분석은 양적 및 질적 단백질 체학 연구를위한 안정적인 isotopically 표시 펩티드를 생성하고 proteotypic 펩티드가 생성되는이 반응 속도론을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, PALeO-TimeCourse는 특정하지 않다는 관련 조건 예를 생체에서…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH / NIDCR 부여 1R01DE019796에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue number |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX |
Table 1. Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 |
Table 2. Reagents
Riferimenti
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