यौन विकास और में Ascospore निर्वहन Fusarium graminearum</em

Summary

यौन पार और पुनः संयोजक संतान के अलगाव filamentous कवक के लिए महत्वपूर्ण अनुसंधान उपकरण हैं,<em> Fusarium graminearum</em> आवश्यक तकनीकों को सफलतापूर्वक बाहर ले जाने के लिए इन प्रक्रियाओं प्रस्तुत कर रहे हैं.

Abstract

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces fruiting bodies, called perithecia, on carrot agar. Perithecia contain numerous tissue types, produced at specific stages of perithecium development. These include (in order of appearance) formation of the perithecium initials (which give rise to the ascogenous hyphae), the outer wall, paraphyses (sterile mycelia which occupy the center of the perithecium until the asci develop), the asci, and the ascospores within the asci¹⁴. The development of each of these tissues is separated by approximately 24 hours and has been the basis of transcriptomic studies during sexual development^12,8. Refer to Hallen et al. (2007) for a more thorough description of development, including photographs of each stage. Here, we present the methods for generating and harvesting synchronously developing lawns of perithecia for temporal studies of gene regulation, development, and physiological processes. Although these methods are written specifically to be used with F. graminearum, the techniques can be used for a variety of other fungi, provided that fruiting can be induced in culture and there is some synchrony to development. We have recently adapted this protocol to study the sexual development of F. verticillioides. Although individual perithecia must be hand picked in this species, because a lawn of developing perithecia could not be induced, the process worked well for studying development (Sikhakolli and Trail, unpublished).

The most important function of fungal fruiting bodies is the dispersal of spores. In many of the species of Ascomycota (ascus producing fungi), spores are shot from the ascus, due to the generation of turgor pressure within the ascus, driving ejection of spores (and epiplasmic fluid) through the pore in the ascus tip^2,7. Our studies of forcible ascospore discharge have resulted in development of a “spore discharge assay”, which we use to screen for mutations in the process. Here we present the details of this assay.

F. graminearum is homothallic, and thus can form fruiting bodies in the absence of a compatible partner. The advantage of homothallism is that crossing is not necessary to generate offspring homozygous for a particular trait, a facet that has facilitated the study of sexual development in this species^14,7. However, heterothallic strains have been generated that can be used for crossing^5,9. It is also possible to cross homothallic strains to obtain mutants for several genes in one strain¹. This is done by coinoculating one Petri dish with 2 strains. Along the meeting point, the majority of perithecia will be recombinant (provided a mutation in one of the parent strains does not inhibit outcrossing). As perithecia age, they exude ascospores en masse instead of forcibly discharging them. The resulting spore exudate (called a cirrhus) sits at the tip of the perithecium and can easily be removed for recovery of individual spores. Here we present a protocol to facilitate the identification of recombinant perithecia and the recovery of recombinant progeny.

Protocol

1. Perithecia उत्पादन एफ के एक उपजाऊ तनाव के साथ एक 6.0 सेमी diam पेट्री डिश में केंद्र टीका लगाना गाजर 10 अगर graminearum (पीएच-1 सिफारिश). कमरे के तापमान (18-24 डिग्री सेल्सियस) पर जगह उज्ज्वल फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत बर्तन और टीका विकसित करने के लिए जब तक फुई पेट्री डिश (3-5 दिन) के बाहरी छोर पर पहुँच गया है की अनुमति देते हैं. वाणिज्यिक घरेलू फ्लोरोसेंट रोशनी फलने शरीर गठन और निर्वहन उत्तेजक के लिए ठीक काम करते हैं. धीरे एक बाँझ दन्तखुदनी के साथ हवाई mycelia हटा दें. सतह के लिए एक बाँझ कांच hockeystick या एक बाँझ कांच वाली छड़ी के गोल अंत के साथ 1.0 मिलीलीटर 2.5% के बीच 60 aq बांटो. प्रकाश के लिए प्लेटें लौटें. प्लेटें Parafilm जोड़ नहीं है. 24 घंटे के बाद, प्लेट की सतह चमकदार उपस्थिति है चाहिए. यदि mycelia reappears, परिमार्जन सतह और फिर से लागू बीच 60 समाधान. अगले सप्ताह से अधिक perithecia के विकास का निरीक्षण करते हैं. के मध्यवर्ती चरणोंperithecium विकास धीरे से अगर और शाही सेना निष्कर्षण (चित्रा 1) के लिए जमे हुए फ़्लैश की सतह scraping द्वारा काटा जा सकता है. परिपक्व spores 7 दिन थाली के ढक्कन पर जमा करेंगे. शुरू में इन केवल एक विदारक खुर्दबीन के नीचे दिखाई हो जाएगा, लेकिन 9 दिन से, वे पर्याप्त घनत्व के लिए जमा के रूप में इतना नग्न आंखों को दिखाई हो. 2. Ascospore निर्वहन परख 6 दिन बीच समाधान के आवेदन के बाद, एक लकड़ी छिद्रक साथ अगर एक 1 सेमी diam चक्र बाहर कटौती. वैकल्पिक रूप से, एक स्केलपेल के लिए एक समान आकार खंड को दूर किया जा सकता है. वृत्त आधे में कटा हुआ जा सकता है और प्रत्येक आधा एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर रखा. ओरिएंट तो फलने निकायों युक्त सतह स्लाइड की सतह पर खड़ा है टुकड़े, और spores नीचे स्लाइड की लंबाई निकाल रहे हैं. एक नमी रोशनी के तहत रात भर कक्ष में स्लाइड रखें. Spores पर जमा करेंगेस्लाइड और नग्न आंखों अगली सुबह (चित्रा 2) दिखाई. संचित spores स्लाइड बंद पानी से धोया जा सकता है और अगर वांछित मात्रा. संभावित ascospore निर्वहन inhibitors परख की विधानसभा के दौरान अगर ब्लॉक के पीछे की ओर के लिए उन्हें जोड़ने के द्वारा assayed किया जा सकता है. कुछ आयन चैनल inhibitors है कि छुट्टी के कम पहले किया गया है इस तकनीक के साथ 15 assayed. 3. पुनः संयोजक संतान की पीढ़ी एफ के दो उपभेदों के साथ गाजर अगर inoculating पार आरंभ graminearum (एक + लीख और एक लीख), पेट्री डिश के विपरीत पक्षों पर टीका अंक दे. एक बार hyphae सतह भर है, हवाई भाग परिमार्जन और बीच 60 समाधान लागू के रूप में ऊपर वर्णित है. एक मार्कर का उपयोग करने के लिए पेट्री डिश की ओर जहां hyphae को पूरा करने पर ध्यान दें. संस्कृतियों को प्रकाश के लिए लौटें और सेते हैं जब तक perithecia विकसित किया है, और cirrhi होबंदूक perithecia से दो संस्कृतियों के बीच चौराहे के साथ फार्म. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत लाने में दो संस्कृतियों के मिलन बिंदु के साथ perithecia देखने के लिए. एक कीट पिन का उपयोग, निष्फल और बाँझ पानी में डूबा हुआ है, इस सीमा के साथ एक cirrhus हल्के को छूने पिन की टिप के साथ. पिन पर नमी cirrhus पिन करने के लिए छड़ी करने के लिए अनुमति चाहिए. Eppendorf spores धोना बंद ट्यूब में 200 μl बाँझ पानी में उस पर cirrhus साथ पिन की नोक कुल्ला. ज्वाला पिन, यह फिर से गीला और अन्य cirrhus उठाओ. 10 से 15 cirrhi उठाओ, और पानी की एक अलग ट्यूब में हर जगह. संक्षिप्त भंवर ट्यूब cirrhi निलंबित युक्त. एक विंदुक और MMTS 1 मध्यम पर एक 9 सेमी पेट्री डिश में जगह के साथ बीजाणु निलंबन के 60 μl निकालें. एक बाँझ हॉकी स्टिक के साथ फैल गया. शेष बीजाणु निलंबन डिग्री सेल्सियस 4 में एक सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है और यदि आवश्यक replated. Incuba3-5 दिनों के लिए कमरे के तापमान (नहीं आवश्यक प्रकाश) में ते तक बहुत छोटी कालोनियों दिखाई देते हैं (चित्रा 3). कालोनियों के बीच में phenotypes की दो प्रकार की हो जाएगा. – लीख कालोनियों लीख कालोनियों से sparser hyphae होगा. पुनः संयोजक perithecia से cirrhi लगभग बराबर अनुपात में दोनों कॉलोनी phenotypes दिखाएगा. उन पर केवल एक ही phenotype की कालोनियों के साथ प्लेट त्यागें. नोट करें कि कभी कभी अधिक से अधिक दो phenotypes अन्य कारकों में से अलगाव के कारण परिणाम. वी 8 या भंडारण के लिए गाजर अगर कालोनियों ले जाएँ. सही फेनोटाइप की पुष्टि, Czapek Dox अग्रवाल (लीख उपभेदों Czapek Dox पर विकास नहीं होगा) पर और क्लोरट साथ (लीख + उपभेदों क्लोरट साथ पीडीए पर नहीं बढ़ेगा 0.5 एम पोटेशियम क्लोरेट) के पीडीए पर टेस्ट कालोनियों. वांछित गुणों के लिए इन कालोनियों की जांच. 4. प्रतिनिधि परिणाम Perithecia उत्पादन लक्ष्य के लिए एक लॉन हैperithecia के बिना किसी भी mycelia या स्पष्ट spores. संस्कृति की सतह काले मखमल (चित्रा 1) समान दिखाई देगा. 24 घंटे के बीच के आवेदन के बाद अगर की सतह एक मामूली चमक होना चाहिए. अगर mycelia फिर से प्रकट होना, फिर थाली नहीं किया गया है पर्याप्त scraped के लिए perithecium विकास को प्रेरित. Ascospore निर्वहन हमेशा जंगली प्रकार तनाव से अपनी परख अगर के कई ब्लॉक में प्रदान करते हैं. यदि उन आग नहीं करते हैं, तो या तो अपने perithecia भी युवा या बहुत पुराने हैं. यदि वे भी पुराने हैं, तो कई hyphae यह एक सफेद रंग देने के संस्कृति की सतह पर दिखाई देगा. यदि यह मामला नहीं है, वे भी जवान हो, और हो सकता है परख 24 घंटे में फिर से कोशिश करनी चाहिए. कभी कभी, संस्कृतियों को अच्छी तरह से निर्वहन नहीं है, और प्रयोग करने के लिए दोहराया जा करना होगा. सुनिश्चित करें कि आप समुचित प्रकाश की शर्तों के तहत परख प्रदर्शन. पुनः संयोजक संतान <p class="jove_content"> पुनः संयोजक perithecia दो उपभेदों के बीच चौराहे साथ perithecia के बहुमत करना चाहिए. हम आम तौर पर एक पार से 10 cirrhi प्रक्रिया और उन में से कम से कम 4-6 पुनः संयोजक होना चाहिए. बहुत कभी कभी, एक परिवर्तन संभोग से एक तनाव से बचाता है. यदि एक माता पिता के एक न्यायपालिका विकास phenotype है, तो अधिक से अधिक 2 phenotypes MMTS पर कालोनियों के बीच मौजूद हो सकता है. चित्रा 1 गाजर अगर perithecium विकास के चरणों. बाएँ, बीच के आवेदन के बाद 72 घंटे. लाल रंग और सतह पर काले अनाज के रूप में बहुत युवा दिखाई perithecia नोट. सही, 144 घंटे में, परिपक्व perithecia के गठन किया है. नोट दोनों संस्कृतियों में सतही mycelia के लगभग पूर्ण अभाव है. चित्रा निर्वहन 2. परख. नारंगी गाजर अगर प्लग उन्मुख इतना थाटी जबरन इसकी सतह पर परिपक्व perithecia से छुट्टी दे दी spores गिलास स्लाइड की सतह पर जमा कर सकते हैं. 15 घंटा संचय समय. चित्रा 3 लीख + और ​​चयनात्मक MMTS मध्यम पर लीख कालोनियों के बीच विकास में अंतर. – लीख कालोनियों (तीर) छोटे होते हैं. लीख + कालोनियों (तीर) को मजबूत वृद्धि दिखा. तस्वीर 7 दिनों के बाद लिया.

Discussion

एफ graminearum विशेष रूप से अच्छी तरह से एक जीनोम अच्छी तरह से एनोटेट (उपलब्धता के कारण फलने शरीर के विकास के अध्ययन के लिए अनुकूलित / mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB , ^4), और एक की उपलब्धता Affymetrix माइक्रोएरे आधारित ^6. यह को ^7,11,3 निर्वहन ascospore लिए महत्वपूर्ण जीन की पहचान करने की क्षमता में मदद की है. यहाँ प्रस्तुत तरीकों के शोधकर्ता एफ के फलने शरीर के आनुवांशिक विश्लेषण के लिए विकास के चरणों और कार्यों का एक असतत सेट पर ध्यान केंद्रित करने के लिए अनुमति देगा graminearum. तरीकों में भी आसानी से संबंधित कवक है कि संस्कृति में फल के लिए प्रेरित किया जा सकता है के लिए अनुकूलनीय है, और अन्य कवक फलने शरीर प्रकार की एक किस्म में विकास के लिए एक मानक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

बीजाणु फायरिंग फेनोटाइप का आकलन करने की क्षमता प्रजातियों जहां spores के छोटे और देखने के लिए मुश्किल हैं, इस तरह के रूप में सूक्ष्म हो सकता है <eमीटर> एफ graminearum. एक साफ स्लाइड पर spores के संग्रह दोनों दृश्य मूल्यांकन, और मात्रात्मक मूल्यांकन की सुविधा के रूप में spores धोया जा सकता है स्लाइड और quantitated. कुछ कवक प्रजातियों एक गोंद है कि उनके बीजाणु और spores बंद नहीं धोए जा सकते हैं चारों ओर उपज है, लेकिन microscopically गिना जाना चाहिए के रूप में वे स्लाइड पर रहते हैं. हम इस Sclerotinia sclerotiorum सच हो पाया है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Fusarium graminearum strain PH-1	Fungal Genetics Stock Center, Kansas	FGSC 9075
Tween 60	Sigma-Aldrich	P1629
Czapek’s Dox Agar	Difco, Becton Dickinson	233810
Potassium Chlorate	Sigma-Aldrich	255572