Questo articolo descrive una sequenza ottimizzata di eventi per l'imaging multimodale di innesti cellulari nel cervello di roditori utilizzando: (i) in bioluminescenza vivo e la risonanza magnetica, e (ii) post mortem l'analisi istologica. La combinazione di queste modalità di imaging su un singolo animale consente la valutazione del trapianto cellulare ad alta risoluzione, sensibilità e specificità.
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Articolo metodologico
Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nel corso dell'ultimo decennio, il trapianto di cellule staminali ha acquisito un crescente interesse come primario o secondario modalità terapeutica per una varietà di malattie, sia negli studi preclinici e clinici. Tuttavia, ad oggi i risultati per quanto riguarda i risultati funzionali e / o la rigenerazione dei tessuti a seguito di trapianto di cellule staminali sono molto diverse. In generale, un beneficio clinico si osserva senza profonda comprensione del meccanismo sottostante (s) 1. Pertanto, gli sforzi multipli hanno portato allo sviluppo di diverse modalità di imaging molecolare per monitorare cellule staminali innesto con l'obiettivo finale di valutare con precisione la sopravvivenza, destino e fisiologia delle cellule staminali innestate e / o loro micro-ambiente. I cambiamenti osservati in uno o più parametri determinati dalla imaging molecolare potrebbe essere correlato all'effetto clinico osservato. In questo contesto, i nostri studi si concentrano sull'uso combinato di imaging bioluminescenza (BLI), risonanza magnetica (MRI) e l'analisi dell istologicas per valutare cellule staminali innesto.
BLI viene comunemente utilizzato per non invasivo eseguire il monitoraggio delle cellule e la sopravvivenza cellulare monitorare in tempo successivo trapianto 2-7, basato su una reazione biochimica in cui le cellule che esprimono il gene reporter luciferasi sono in grado di emettere luce seguente interazione con il suo substrato (per esempio D- luciferina) 8, 9. MRI invece è una tecnica non invasiva che è clinicamente applicabile 10 e può essere utilizzata per localizzare con precisione innesti cellulari ad altissima risoluzione 11-15, sebbene la sua sensibilità dipende fortemente dal contrasto generato dopo marcatura delle cellule con un agente di contrasto MRI . Infine, post-mortem analisi istologica è il metodo di scelta per convalidare i risultati della ricerca ottenuti con tecniche non invasive con la più alta risoluzione e sensibilità. Inoltre end-point analisi istologica ci permette di eseguire una dettagliata analisi fenotipica delle cellule innestate e / o il tessuto circostante, based sull'uso di proteine reporter fluorescenti e / o etichettatura diretto di cellule con anticorpi specifici.
In sintesi, siamo qui visivamente dimostrare la complementarietà di BLI, MRI e istologia di svelare cellule staminali e diversi / o l'ambiente associate le seguenti caratteristiche innesto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi. Come esempio, midollo osseo, le cellule stromali geneticamente ingegnerizzati per esprimere la proteina fluorescente verde maggiore (EGFP) e luciferasi di lucciola (Fluc), e marcato con blu di ferro particelle fluorescenti dimensioni micron di ossido (MPIOs), verrà innestata nella SNC di topi immuno-competenti ei risultati saranno monitorati da BLI, MRI e istologia (Figura 1).
Protocollo
1. Preparazione cellulare
- Gli esperimenti deve essere iniziato con ex vivo in coltura popolazioni di cellule staminali geneticamente modificate per esprimere le proteine reporter della luciferasi e eGFP. Qui usiamo Luciferase / eGFP-murine esprimono osseo cellule stromali derivate dal midollo (BMSC-Luc/eGFP) come precedentemente descritti da Bergwerf et al. 2, 5.
- Due giorni prima marcatura delle cellule, le cellule BMSC-Luc/eGFP piastra ad una densità di 8 x 10 5 cellule per T75 pallone coltura in 15 ml di terreno di espansione completa (CEM) supplementato con 1 pg / ml Puromycine.
- Permettere alle cellul....
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Discussione
In questo rapporto, descriviamo un protocollo ottimizzato per la combinazione di tre modalità di imaging complementari (BLI, MRI e istologia) per la caratterizzazione dettagliata degli impianti cellulari nel SNC di topi immuni competenti. Una combinazione di etichettatura gene reporter di cellule, basata sulla modificazione genetica con i geni reporter lucciola, luciferasi e eGFP, e una cella di etichettatura diretta con GB MPIO, porta ad una valutazione accurata degli innesti di cellule staminali in vivo.
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato sostenuto da autori di assegno di ricerca ID-BOF 2006 dell'Università di Anversa (concessa a PPO e AVDL), con assegno di ricerca G.0136.11 e G.0130.11 (concessa a AVDL, ZB e PPO) e 1.5.021.09. N.00 (concessa a PPO) del Fondo per la ricerca scientifica-Flanders (FWO-Vlaanderen, Belgio), da SBO assegno di ricerca IWT-60838: BRAINSTIM dell'Istituto fiammingo per la Scienza e la Tecnologia (concessi a ZB e AVDL), in parte da una ricerca Methusalem borsa di studio del governo fiammingo (concessa a ZB), in parte da EC-FP6-NoE DIMI (LSHB-CT-2005-512146), EC-FP6-NoE EMIL (LSHC-CT-2004-503569) , e dalla Università Inter poli di attrazione IUAP-NIMI-P....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| IMDM | Lonza | BE12-722F | Componente del CEM mezzo di crescita delle cellule |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10270-106 | Componente del CEM mezzo di crescita delle cellule |
| Siero di cavallo | Gibco | 1605-122 | Componente del CEM mezzo di crescita delle cellule |
| Penicillina-streptomicina | Gibco | 15140 | Componente del CEM mezzo di crescita delle cellule |
| Fungizone | Gibco | 15290-018 | Componente del CEM mezzo di crescita delle cellule |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Puromycine | Invivogen | ant-pr-1 | |
| tripsina | Gibco | 25300 | |
| GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
| D-luciferina | Promega | E1601 | |
| Ketamina (Ketalar) | Pfizer | ||
| Xilazina (Rompun) | Bayer Sanità | ||
| Isoflurano | Isoflo | 05260-05 | |
| 0,9% NaCl | Baxter | ||
| paraformaldeide | Merck | 1.04005.1000 | |
| saccarosio | Applichem | A1125 | |
| Micro-pompa di iniezione | KD scientifica | KDS100 | |
| Photon imager | Biospace Lab | ||
| 9.4T MR scanner | Bruker Biospin | Biospec 94/20 USR | |
| BX51 microscopio | Olimpo | BX51 | |
| Mycrom HM criostato | Prosan | HM525 | |
| siringa | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 gauge | Hamilton | 7762-03 | |
| Foto Vision software | Biospace Lab | ||
| M3vision software | Biospace Lab | ||
| ParaVision 5,1 software | Bruker Biospin | ||
| Amira 4,0 software | Visage Imaging |
Riferimenti
- Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. Molecular imaging of stem cells. , (2008).
- Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in....
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Ristampe e permessi
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