تنقية والتصور من Lipopolysaccharide من البكتريا سالبة الجرام بواسطة استخراج مائي، الفينول الساخن
Summary
نحن تصف تعديل حار طريقة استخراج مائي، الفينول لتنقية lipopolysaccharide (بي إس) من الجراثيم سلبية الغرام. انتزعت مرة، يمكن تحليلها في وقت لاحق من قبل LPS SDS-PAGE وتصور من قبل تلطيخ مباشرة أو طخة مناعية الغربية.
Abstract
Lipopolysaccharide (LPS) عنصرا رئيسيا من الأغشية سلبية الغرام الخارجي الجرثومي. هذا هو جزيء الدهون الثلاثية التي تتكون من ألف والذي يتجسد في الغشاء الخارجي، وهو جوهر oligosaccharide وتكرار O-مستضد الوحدات التي تمتد إلى الخارج من سطح الخلية 1 و 2. LPS هو جزيء سائد مناعيا أن المهم بالنسبة للخبث والتسبب في العديد من الأنواع البكتيرية، بما في ذلك الزائفة الزنجارية، والأنواع السالمونيلا، والإشريكية القولونية 3-5، والاختلاف في شكل LPS تكوين O-مستضد أساس التنميط المصلي من السلالات. وتشارك LPS في المرفق لاستضافة خلايا في بدء الإصابة، ويوفر حماية من تكملة بوساطة القتل؛ السلالات التي تفتقر LPS يمكن أن تكون مخففة عن خبث 6-8. لهذه الأسباب، من المهم أن تصور LPS، وخاصة من السلالات الإكلينيكية. تصور LPS النطاقات أنماط واعتراف محدد 1ويمكن أن تكون أدوات مفيدة ntibodies لتحديد الأنساب وسلالة لتوصيف مختلف المسوخ.
في هذا التقرير، وصفنا ساخنة مائي، الفينول طريقة لعزل وتنقية LPS من سلبية الغرام الخلايا البكتيرية. هذا البروتوكول يسمح لاستخراج LPS بعيدا عن الأحماض النووية والبروتينات التي يمكن أن تتداخل مع تصور من LPS التي تحدث مع أقصر، وطرق استخلاص أقل كثافة 9. أعد LPS يمكن فصلها بهذه الطريقة من قبل كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS)-بولكرلميد الكهربائي للهلام (صفحة) والملون مباشرة باستخدام الكربوهيدرات / بروتين سكري البقع أو معيار أساليب تلطيخ الفضة. العديد من الأمصال المضادة لللLPS تحتوي على الأجسام المضادة التي مع بروتينات الغشاء الخارجي أو الأهداف المستضدية الأخرى التي يمكن أن تعوق عبور رد فعل، لوحظ التفاعل بعد طخة مناعية الغربية من SDS-PAGE-فصل lysates خلية النفط الخام. علاج البروتيني من lysates خلية النفط الخام وحدها ليست دائما وسيلة فعالة لإزالة هذهالخلفية باستخدام هذا التصور أو أساليب أخرى. كذلك، يمكن معالجة الأنزيم البروتيني واسعة في محاولة لإزالة هذه الخلفية تؤدي إلى LPS جودة الفقيرة التي لم يتم حلها بشكل جيد من قبل أي من الطرق المذكورة أعلاه. لهذه الأسباب، فإننا نعتقد أن البروتوكول التالي، المقتبس من Westpahl وجن 10، يعتبر مثاليا لاستخلاص LPS.
Protocol
Discussion
وقد وصفت لنا وسيلة لتنقية LPS بعيدا عن مكونات الخلية الأخرى، بما فيها الأحماض النووية والبروتينات. هذه الطريقة توفر جودة عالية LPS التي يمكن استخدامها في عدد من الطرق تصور مختلف، بما في ذلك الكربوهيدرات من تلطيخ SDS-PAGE المواد الهلامية، كما هو مبين في الشكل رقم 1. ويمكن است…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة التليف الكيسي.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 04716728001 |
| RNase A | Roche | 10109169001 |
| Proteinase K | Fisher | BP1700 |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher | BP1750-100 |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes | P20495 |
Riferimenti
- Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
- Valvano, M. A. Export of O-specific lipopolysaccharide. Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).
- Pier, G. B. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity. Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).
- Freudenberg, M. A. Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria. Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).
- Jann, K., Jann, B. Polysaccharide antigens of Escherichia coli. Rev. Infect. Dis. 9, S517-S526 (1987).
- McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing. Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).
- Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains. Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).
- Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins. Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).
- Hitchcock, P. J., Brown, T. M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels. J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).
- Westphal, O., Jann, K. Bacterial lipopolysaccharides. Methods Carbohyr. Chem. 5, 83 (1965).
- Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. Nat Genet. , (2011).
