热酚水提取纯化及革兰氏阴性菌脂多糖的可视化
Summary
我们描述一个净化革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）的修改热水溶液中苯酚的提取方法。一旦提取，内毒素可随后通过SDS-PAGE分析，并通过可视化的直接染色或西方免疫。
Abstract
脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要组成部分。这是一个劳，资及政府三方代表组成的脂质分子组成，这是嵌入在外膜，核心寡糖和重复单位向外延伸，从表面的细胞1，2 O-抗原。 LPS是一种免疫分子的毒力和发病机制中的许多种细菌，包括绿脓杆菌，沙门氏菌和大肠杆菌 3-5，LPS O-抗原组成形式株血清型分型的基础上的差异是很重要的。脂多糖在附件涉及申办开始在感染的细胞和补体介导的杀戮提供保护;缺乏内毒素的菌株可能是致病的减毒6-8。由于这些原因，重要的是脂多糖，可视化，尤其是从临床分离。带特定A模式和识别的可视化脂多糖ntibodies可以成为有用的工具，识别应变谱系和各种突变体的特点。
在这份报告中，我们描述为革兰氏阴性细菌细胞内毒素的分离和净化水热酚法。该协议允许提取脂多糖远离核酸和蛋白质，可以干扰可视化与内毒素，发生时间较短，较不密集的提取方法9。脂多糖准备，这种方式可以通过十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和直接使用碳水化合物/糖蛋白污渍或标准的银染方法染色分开。许多抗血清对LPS含有抗体的交叉反应与外膜蛋白或其他抗原的目标，可以阻碍粗细胞裂解物的SDS-PAGE分隔后，西方免疫反应观察。原油单细胞裂解蛋白酶处理并不总是一个有效的方式消除这种背景使用或其他可视化方法。此外，在试图消除这种背景下广泛的蛋白酶处理可能导致质量低劣，没有很好地解决上述任何一种方法的毒素。由于这些原因，我们认为以下协议，从Westpahl和Jann 10改编，是理想的毒素提取。
Protocol
Discussion
我们所描述的脂多糖远离其他细胞成分，包括核酸和蛋白质纯化的方法。这种方法提供了高品质的脂多糖，可以在许多不同的可视化方法，如在图1所示，包括碳水化合物SDS-PAGE凝胶染色用。这种方法可用于从各种不同的菌株血清型的毒素，用特异性抗血清，或显示直视的菌株之间的相关性。例如，最近的全基因组测序与LPS表征结合项目B 的爆发dolosa领导发现，与这些菌株在11?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由国家机构的健康和囊性纤维化基金会的赞助支持。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 04716728001 |
| RNase A | Roche | 10109169001 |
| Proteinase K | Fisher | BP1700 |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher | BP1750-100 |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes | P20495 |
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