Purificação e visualização de lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas por extracção aquosa de fenol-Hot
Summary
Nós descrevemos um método modificado de extracção a quente aquoso-fenol para a purificação de lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias Gram-negativas. Uma vez extraído, os LPS pode ser subsequentemente analisadas por SDS-PAGE e visualizados por coloração directa ou imunotransferência Western.
Abstract
Lipopolissacarídeo (LPS) é um componente importante da bacteriana gram-negativa membranas externas. É uma molécula tripartido consistindo de lípido A, que é incorporado na membrana externa, um núcleo de oligossacáridos e repetindo O-antigénio unidades que se estendem para fora a partir da superfície da célula 1, 2. LPS é uma molécula imunodominante que é importante para a virulência e patogénese de muitas espécies bacterianas, incluindo Pseudomonas aeruginosa, espécies de Salmonella e Escherichia coli 3-5, e as diferenças na forma de composição LPS O-antigénio a base para serotipagem de estirpes. LPS está envolvido na ligação a células hospedeiras no momento do início da infecção e fornece protecção contra a morte mediada pelo complemento; estirpes que carecem de LPS pode ser atenuado para a virulência 6-8. Por estas razões, é importante para a visualização de LPS, particularmente a partir de isolados clínicos. LPS Visualizing bandas padrões e reconhecimento por um específicontibodies podem ser ferramentas úteis para identificar linhagens de deformação e caracterizar vários mutantes.
Neste relatório, nós descrevemos um método aquosa-fenol quente para o isolamento e purificação de LPS de bactérias Gram-negativas células bacterianas. Este protocolo permite a extracção de LPS de distância a partir de ácidos nucleicos e proteínas que podem interferir com a visualização do LPS, que ocorre com mais curtos, métodos de extracção menos intensivos 9. LPS preparados desta maneira podem ser separados por dodecilsulfato de sódio (SDS)-poliacrilamida electroforese em gel (PAGE) e directamente corado usando hidrato de carbono / glicoproteína manchas ou métodos de coloração padrão de prata. Muitos anti-soros para LPS conter anticorpos que reagem de forma cruzada com as proteínas da membrana externa ou alvos antigénicos outros que podem dificultar a reactividade observados após immunoblot ocidental de SDS-PAGE separados lisados celulares brutos. Tratamento com protease de lisados celulares brutos por si só não é sempre uma forma eficaz de remoção destafundo de usar este ou outros métodos de visualização. Além disso, o tratamento da protease extensa, numa tentativa de remover este pano de fundo pode levar a LPS de baixa qualidade que não é bem resolvidos por qualquer um dos métodos acima mencionados. Por estas razões, acreditamos que o protocolo seguinte, adaptado de Westpahl e Jann 10, é ideal para a extracção de LPS.
Protocol
Discussion
Nós descrevemos um método de purificação de LPS de distância a partir de outros componentes celulares, incluindo ácidos nucleicos e proteínas. Este método proporciona alta qualidade LPS que podem ser utilizados num certo número de métodos de visualização diferentes, incluindo coloração de hidratos de carbono géis de SDS-PAGE, como mostrado na Figura 1. Este método pode ser usado para serotipar LPS a partir de uma variedade de estirpes, utilizando anticorpos específicos anti-soros, ou para mostrar parent…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde ea Fundação de Fibrose Cística.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 04716728001 |
| RNase A | Roche | 10109169001 |
| Proteinase K | Fisher | BP1700 |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher | BP1750-100 |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes | P20495 |
Riferimenti
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