Rensing og Visualisering av lipopolysakkarid fra Gram-negative bakterier ved Hot Vandig-fenol Extraction

Summary

Vi beskriver en modifisert hot vandig-fenol utvinning metode for rensing av lipopolysakkarid (LPS) fra Gram-negative bakterier. Når utvinnes, kan LPS bli senere analyseres av SDS-PAGE og visualisert ved direkte farging eller vestlig immunoblot.

Abstract

Lipopolysakkarid (LPS) er en viktig komponent av Gram-negative bakterielle ytre membranene. Det er en tredelt molekyl som består av lipid A, som er innebygd i den ytre membranen, en kjerne oligosakkarid og repeterende O-antigen enheter som strekker seg utover fra overflaten av cellen ^{1, 2.} LPS er en immunodominant molekyl som er viktig for virulens og patogenese av mange bakteriearter, inkludert Pseudomonas aeruginosa, Salmonella arter, og Escherichia coli ^3-5, og forskjeller i LPS O-antigen sammensetning danner grunnlaget for serotyping stammer. LPS er involvert i vedlegg til vertsceller ved initiering av smitte og gir beskyttelse mot komplement-mediert drap, stammer som mangler LPS kan dempes for virulens ^6-8. Av disse grunner er det viktig å visualisere LPS, spesielt fra kliniske isolater. Visualisere LPS banding mønstre og anerkjennelse ved spesifikk enntibodies kan være nyttige verktøy for å identifisere belastningsskader linjene og å karakterisere ulike mutanter.

I denne rapporten beskriver vi en varm vandig-fenol metode for isolering og rensing av LPS fra Gram-negative bakterielle celler. Denne protokollen tillater utvinning av LPS unna nukleinsyrer og proteiner som kan forstyrre visualisering av LPS som skjer med kortere, mindre intensive hentingsmetodene ^9. LPS forberedt på denne måten kan skilles ved natrium dodecyl sulfat (SDS)-polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) og direkte beiset med karbohydrater / glykoprotein flekker eller standard sølv flekker metoder. Mange anti-sera til LPS inneholde antistoffer som kryssreagerer med ytre membran proteiner eller andre antigene mål som kan hindre reaktivitet observert etter Western immunoblot av SDS-PAGE-skilt råolje celle lysates. Protease behandling av råolje celle lysates alene er ikke alltid en effektiv måte å fjerne dettebakgrunn bruker denne eller andre visualisering metoder. Videre kan utstrakt protease behandling i et forsøk på å fjerne denne bakgrunn føre til dårlig kvalitet LPS som ikke er godt løst av noen av de nevnte metodene. Av disse grunner, mener vi at følgende protokoll, tilpasset fra Westpahl og Jann ^10, er ideelt for LPS utvinning.

Protocol

1. Utarbeidelse av bakterier for LPS Extraction Begynn en overnatting kultur i 5 ml Luria buljong (LB), supplert med antibiotika hvis nødvendig. Grow kultur natten (12-18 timer) i en rystelse inkubator ved 37 ° C og 200 rpm. Fortynn kulturen 01:10 med LB og ta en OD 600 lesing i et spektrofotometer. Basert på OD 600 lesing, foreta en 1,5 ml suspensjon av bakterier til en OD 600 på 0,5. Pellet bakterier i en mikrosentrifuge på 10 600 x gi 10 mi…

Discussion

Vi har beskrevet en metode for rensing LPS unna andre cellulære komponenter, inkludert nukleinsyrer og proteiner. Denne metoden gir høy kvalitet LPS som kan brukes i en rekke ulike visualisering metoder, inkludert karbohydrat farging av SDS-PAGE geler, som vist i Figur 1. Denne metoden kan brukes til å serotype LPS fra en rekke stammer, med bestemte anti-sera, eller å vise slektskap mellom isolatene ved direkte visualisering. For eksempel, en fersk genom-wide sekvensering prosjekt i kombinasjon med LPS karakteriseri…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	04716728001
RNase A	Roche	10109169001
Proteinase K	Fisher	BP1700
Tris-Saturated Phenol	Fisher	BP1750-100
Diethyl Ether	Thomas Scientific	C313K31
Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit	Molecular Probes	P20495