Summary
Primære hepatocytter gi et verdifullt verktøy for å evaluere biokjemiske, molekylære, og metabolske funksjoner i en fysiologisk relevant eksperimentelt system. Vi beskriver en pålitelig protokoll for rotte in situ lever perfusjon, som konsekvent genererer levedyktige hepatocytter opp to1.0 × 10<sup> 8</sup> Celler per forberedelse med celleviabilitet mellom 88 ~ 96%.
Abstract
Primær hepatocytter kulturen er et verdifullt verktøy som er mye brukt i grunnforskning av leverfunksjonen, sykdom, patofysiologi, farmakologi og andre relaterte fag. Metoden er basert på to-trinns collagenase perfusjon for isolering av intakte hepatocytter ble først introdusert av Berry og kollega i 1969 en, og siden da har gjennomgått mange endringer. Den mest brukte teknikken ble beskrevet av Seglenin 1976 2. I hovedsak, hepatocytter er skilt fra anesteserte voksne rotter av en ikke-resirkuleringsanlegg collagenase perfusjon gjennom portvenen. De isolerte cellene blir deretter filtrert gjennom en 100 mikrometer porestørrelse mesh nylon filter, og dyrkes på plater. Etter fire timers kultur, er det medium erstattes med serum-holdig eller serum-fri medium, f.eks HepatoZYME-SFM, for ekstra tid til kultur. Disse prosedyrene krever kirurgiske og steril kultur tiltak som kan bedre demonstrert av video enn med tekst. Here, dokumentere vi detaljert fremgangsmåte for disse prosedyrene av både video og skriftlig protokoll, som lar konsekvent i produksjon av levedyktige hepatocytter i store tall.
Protocol
Discussion
Primær kultur for hepatocytter er en in vitro modell mye brukt til å studere ulike sider ved leveren fysiologi og patologi. For eksempel er primær kultur brukes til å vurdere uttrykk og funksjon av narkotika-enzymer, inkludert cytokrom P450, narkotika metabolisme, legemiddelinteraksjoner, og mekanismene for cytotoksisitet og gentoksisitet 3-7. Protokollen beskriver isolering og kultur av rotte hepatiske celler er tilpasset fra de tidligere rapportene om Aiken et al. 8, og andr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Mr. Josh Basford og Dr. Xiao-min Li for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH tilskudd (DK70992 og DK92779 til ML).
Riferimenti
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Saito, K., Kobayashi, K., Mizuno, Y., Fukuchi, Y., Furihata, T., Chiba, K., Schmidt, M., Schmitz, H. J., Baumgart, A., Guedon, D. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) agonists induce constitutive androstane receptor (CAR) and cytochrome P450 2B in rat primary hepatocytes. Drug Metab. Pharmacokinet. 25, 108-111 (2010).
- Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Curr. Drug Metab. 5, 443-462 (2004).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar. J. 6, 169 (2007).
- Bu, S. Y., Mashek, D. G. Hepatic long-chain acyl-CoA synthetase 5 mediates fatty acid channeling between anabolic and catabolic pathways. J. Lipid Res. 51, 3270-3280 (2010).
- Aiken, J., Cima, L., Schloo, B., Mooney, D., Johnson, L., Langer, R., Vacanti, J. P. Studies in rat liver perfusion for optimal harvest of hepatocytes. J. Pediatr. Surg. 25, 140-144 (1990).
- Jauregui, H. O., McMillan, P. N., Hevey, K., Naik, S. A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocyte cell surfaces. In Vitro Cell. 24, 401-412 (1988).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
