זיהוי ובידוד של תאים מתחלקים לאט בGlioblastoma האנושי באמצעות Carboxy fluorescein Succinimidyl אסתר (CFSE)
Summary
פרוטוקול וידאו זה מדגים את היישום של צבע carboxyfluorescein succinimidyl אסתר הניאון (CFSE) לזיהוי וההפרדה של תת אוכלוסיות שונות של תאים בגליובלסטומה האנושית המבוססות על תדר של חלוקת תא.
Abstract
ההטרוגניות גידול מייצגת תכונה מהותית תמיכת חוסן גידול ומהווה מכשול מרכזי לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות 1. כדי להתגבר על הבעיה של ההטרוגניות גידול, הוא חיוני לפיתוח מבחנים וכלים המאפשרים זיהוי פנוטיפית, (EPI) גנטי ופונקציונלי ואפיון של אוכלוסיות סרטניות המניעות פתולוגיות מחלות ספציפיות ומייצגים יעדים רלוונטיים קליני. עכשיו זה מבוסס היטב כי גידולי התערוכה ייחודיים משנה שברים של תאים עם תדרים שונים של חלוקת תא, וכי הקריטריונים התפקודיים של רכיבה איטית להיות קשורים באופן חיובי עם יכולת היווצרות גידול במספר סוגי סרטן, כוללים אלה של המוח, שד, העור ו לבלב כמו גם ללוקמיה 2-8. פלורסנט לצבוע carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) שמשה למעקב אחר חלוקת התדרים של תאים במבחנה ובחי בt דם נישאumors וגידולים מוצקים, כגון גליובלסטומה 2,7,8. פרו תרופת התא permeant הלא הניאון של CFSE מומרת על ידי esterases התאי לתוך מתחם ניאון, שנשמר בתוך תאים על ידי קוולנטית מחייבת לחלבונים באמצעות תגובה של מחצית succinimidyl עם קבוצות אמינות תאיות ליצור קשרים אמידים יציבים 9. הצבע הזרחני מופץ באופן שווה בין תאי בת על חטיבות, שמוביל את halving של עוצמת הקרינה בכל חלוקת תא. הדבר זה מאפשר מעקב של תדר מחזור התא עד 8-10 סיבובים של חטיבה 10. קיבולת אצירת CFSE שמשה עם תאים סרטניים במוח כדי לזהות ולבודד subpopulation רכיבה איטית (5% עליונים תאי צבע התמך-) הוכיח להיות מועשרים בפעילות תאי גזע הסרטן 2.
פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה של הכתמת תאים עם CFSE והבידוד של אוכלוסיות בודדות בתוך תרבות של glio האנושיblastoma (GBM)-ליטול תאים בעלי שיעורי חלוקה שונה באמצעות cytometry הזרימה 2. הטכניקה משמשת כדי לזהות ולבודד אוכלוסיית רכיבה איטית גידול במוח של תאים בזכות היכולת שלהם לשמור על תיוג CFSE.
Protocol
Discussion
מספר גדל והולך של מחקרים הוכיח את החשיבות של-תא תת איטי חלוקה-תאים בסרטן אשר תורמים להיווצרות גידול ועמידות לטיפול 2-8. לכן זה קריטי לתיאור ולתקנן שיטות ניסיוניות המאפשרות מחקר של תת אוכלוסיות ספציפיות זה של תאים או באופן כללי יותר להשוואת אוכלוסיות עם שיעורי צמ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מרכז פלורידה לחקר סרטן המוח, פרסטון א ולס ג'וניור המרכז לריפוי סרטן המוח והמכונים הלאומיים לבריאות (1R21CA141020-01).
Materials
| Name of the reagent | Tipo | Company | Catalogue number |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Fluorescent Cell Division Tracking Dye | Molecular Probes, Invitrogen | C34554 |
Riferimenti
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
