Nonostante gli sforzi volti a culture di transizione a feeder liberi condizioni, la derivazione e la cultura di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimangono in gran parte dipendente dal co-colture con alimentatori embrionali di topo (MEF). Qui vi mostriamo una nuova metodologia per la rapida rimozione di alimentatori da culture hESC prima della sperimentazione.
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Articolo metodologico
Fibroblast rimozione veloce da alta densità Culture staminali embrionali umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mouse fibroblasti embrionali (MEF) sono stati usati per creare cellule staminali embrionali umane (hESC) colture dopo l'isolamento blastocisti 1. Questo sistema di alimentazione mantiene hESCs dal subire differenziazione spontanea durante l'espansione delle cellule. Tuttavia, questo metodo di co-cultura è un lavoro dispendioso, richiede personale altamente qualificato, e la purezza hESC rendimenti bassi 4. Molti laboratori hanno tentato di minimizzare il numero di cellule feeder in colture hESC (cioè incorporando matrice rivestite piatti o altri tipi di cellule alimentatore 5-8). Questi sistemi di coltura modificati hanno mostrato qualche promessa, ma non hanno soppiantato il metodo standard per hESC coltura con fibroblasti di topo mitomicina C trattati con embyronic al fine di ritardare indesiderato differenziazione spontanea delle culture hESC. Pertanto, le cellule di alimentazione utilizzati in espansione hESC devono essere rimosse durante esperimenti di differenziazione. Sebbene diverse tecniche sono disponibili per purificare il co hESClonies (FACS, MACS, o l'uso di vettori resistenti ai farmaci) da alimentatori, queste tecniche sono alta intensità di manodopera, costoso e / o distruttiva per la cellule staminali embrionali umane. Lo scopo di questo progetto è stato quello di inventare un metodo di purificazione che consente la raccolta di una popolazione pura di hESC. Abbiamo osservato che in una cultura hESC confluenti, la popolazione MEF può essere rimosso con una semplice e rapida aspirazione del foglio MEF. Questa rimozione dipende da diversi fattori, tra laterale cellula-cellula legame di MEFs che hanno una bassa affinità di legame alla piastra di coltura stirene, e la capacità di colonie di cellule staminali per spingere i fibroblasti verso l'esterno durante la generazione della propria " di nicchia ". Il hESC sono stati poi esaminati per SSE-4, Oct3 / 4 e Tra 1-81 espressione fino a 10 giorni dopo la rimozione MEF per garantire il mantenimento della pluripotenza. Inoltre, le colonie hESC sono stati in grado di continuare a crescere in grandi formazioni da dopo la rimozione del MEF, che fornisce un ulteriore livello di espansione cellule staminali embrionali umane.
Protocollo
1. Preparazione di Alimentatori embrionali di topo
- Il MEFs utilizzato nella co-coltura delle hESC devono essere preventivamente trattati mediante irradiazione o mitomicina-C per inibire le cellule dalla fase di divisione.
- Due ore prima della semina MEF, cappotto ogni plasma 60 mm trattato piastra di coltura con 2 ml di 0,05% gelatina.
- Scongelare una fiala di trattato MEF e piastra a ~ 20.000 cellule / cm 2.
- Consentire alle cellule di aderire durante la notte.
2. Co-semina hESC sul MEF
- Nuove colonie possono essere avviate da colture crioconservati o passaging culture attu....
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Discussione
Il metodo presentato in questo manoscritto offre un'alternativa rapida e meno costosa per eliminare cellule di alimentazione fibroblasti umani da colture di cellule embrionali. Un'efficace rimozione dei fibroblasti dipende dall'esistenza di un monostrato confluente strettamente di queste cellule che si sviluppa in colture di cellule staminali più lunghi. Dopo 7-10 giorni, le colonie hESC crescenti spingerà i fibroblasti feeder in una direzione verso l'esterno, generando un monostrato di fibroblasti sempr.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da un premio II Facoltà di nuovo dal California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), e un NIH-finanziato Premio Nazionale delle Ricerche (F32-HL104924)
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Nucleo cellulare Marker |
| SSE-4 | Millipore | MAB4304 | Umano ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Umano ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Differenziazione marker precoce |
| Tradi-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Umano ESC Marker |
Tabella 1. Tabella di motivi specificisignori utilizzato per la immunocolorazione cellule staminali embrionali umane.
Riferimenti
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blas....
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