Schnelle Fibroblast Entfernung aus High Density humanen embryonalen Stammzellen Kulturen
Summary
Trotz anhaltender Bemühungen, um den Übergang Kulturen Feeder-freien Bedingungen, bleiben die Ableitung und Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES) weitgehend abhängig von Co-Kulturen mit embryonalen Feeder (MEF). Hier zeigen wir eine neuartige Methode zur schnellen Beseitigung Zubringer vom hESC Kulturen vor den Experimenten.
Abstract
Embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) wurden verwendet, um menschliche embryonale Stammzellen (hES) Kulturen nach Blastozyste Trennung 1 zu etablieren. Dieser Anleger System hält hESCs vom unterziehen spontane Differenzierung während der Zellteilung Expansion. Allerdings ist diese Co-Kultur-Methode arbeitsintensiv, erfordert hoch qualifiziertes Personal, und die Renditen niedrig hESC Reinheit 4. Vielen Laboratorien haben versucht, die Anzahl von Feeder-Zellen in Kulturen hESC (dh Einbeziehung Matrix-beschichteten Schalen oder andere Zelltypen Feeder 5-8) zu minimieren. Diese modifizierten Kultur-Systeme haben einige Versprechen gezeigt, aber nicht die Standard-Methode zur Kultivierung hESCs mit Mitomycin C-behandelten Maus embyronic Fibroblasten um unerwünschte spontane Differenzierung der hESC Kulturen verzögern verdrängt. Daher sollten die Feeder-Zellen in hESC Expansion verwendet während der Differenzierung Experimenten entfernt werden. Obwohl mehrere Techniken zur Reinigung des hESC Zusammenarbeit zur Verfügunglonies (FACS, MACS, oder die Verwendung von resistenten Vektoren) von Feeder, sind diese Techniken arbeitsintensiv, teuer und / oder schädlich für die hESC. Das Ziel dieses Projektes war es, ein Verfahren zur Reinigung, die die Ernte von einer reineren Bevölkerung hESCs ermöglicht erfinden. Wir haben beobachtet, dass in einer konfluenten hESC Kultur, die MEF Population entfernt kann mit einer einfachen und schnellen Absaugen des MEF Blatt werden. Diese Entfernung ist abhängig von verschiedenen Faktoren, darunter seitliche Zell-zu-Zell-Bindung MEFs, die eine niedrigere Bindungsaffinität für das Styrol Kulturschale haben, und die Fähigkeit der Stammzellenkolonien die Fibroblasten nach außen während der Erzeugung der eigenen push " Nische ". Der HES wurden dann für SSEA-4, Oct3 / 4 und 1 bis 81 Tra Expression bis zu 10 Tage nach Entfernung MEF untersuchenden Aufrechterhaltung der Pluripotenz zu gewährleisten. Darüber hinaus waren hESC Kolonien in der Lage, weiter zu wachsen aus in größeren Formationen nach MEF Entfernung und bietet eine zusätzliche Ebene der hESC Expansion.
Protocol
Discussion
Das Verfahren in diesem Manuskript vorgelegt bietet eine schnelle und kostengünstigere Alternative zu eliminieren Fibroblasten-Feeder-Zellen aus menschlichen embryonalen Zellkulturen. Die erfolgreiche Entfernung von Fibroblasten ist abhängig vom Vorhandensein eines dicht konfluente Monoschicht von diesen Zellen, die in mehr Stammzellkulturen entwickelt. Nach 7-10 Tagen werden die wachsenden hESC Kolonien den Feeder-Fibroblasten in einer Richtung nach außen zu drücken, erzeugen ein immer dichter werdendes Fibroblaste…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von einem New Faculty Award II vom California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1) und einer NIH-finanzierten National Research Award (F32-HL104924) finanziert
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.
Riferimenti
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