בזמן אמת הדמיה דיגיטלית של אינטראקציה ליקוציט-אנדותל של פגיעה איסכמיה reperfusion (IRI) של השריר Cremaster עכברוש
Summary
מיקרוסקופ דיגיטלי intravital epifluorescence של venules postcapillary ב microcirculation cremasteric היא שיטה נוחה להבנה טובה של אינטראקציה ליקוציט-אנדותל<em> In vivo</em> לפציעה איסכמיה reperfusion (IRI) של רקמת שריר מפוספס. אנחנו כאן לספק פרוטוקול מפורט בצורה בטוחה לבצע את טכניקת ולדון היישומים שלה והמגבלות.
Abstract
איסכמיה reperfusion פציעה (IRI) היה מעורב במגוון גדול של מצבים פתולוגיים כגון שבץ מוחי, אוטם שריר הלב, איסכמיה במעי, כמו גם בעקבות reperfusion השתלת ניתוח לב וכלי דם 1. של רקמה איסכמית בעבר, בעוד חיוני למניעת בלתי הפיך רקמת פציעה, מעורר דלקת מופרזת של רקמת המושפעת. סמוך הייצור של מינים החמצן מגיב, הפעלה של מערכת המשלים והגדילה את חדירות כלי הדם, את ההפעלה של leukocytes הוא אחד השחקנים עיקרון מפל פתולוגית של נזק לרקמה הדלקתית במהלך reperfusion. 2, 3 הפעלת ליקוציט הוא תהליך רב שלבי הכולל של גלגול, הדבקה איתן גלגול, והוא מתווך על ידי פעילות גומלין בין מולקולות הדבקה בתגובה chemoattractants כגון גורמים משלימים, כמוקינים, או טסיות דם, הפעלת גורם. 4
<p class = "jove_content"> בעוד מתגלגל ליקוציט ב venules postcapillary מתווכת בעיקר עם ligands מרשם שלהם, הדבקה של חברת leukocytes כדי האנדותל הוא selectin מבוקר באמצעות כבילת מולקולות הדבקה אינטר (ICAM) וכלי דם הסלולר על ידי האינטראקציה של selectins 5 מולקולות הדבקה (VCAM). 6, 7תקן הזהב עבור בהתבוננות vivo של אינטראקציה ליקוציט-האנדותל היא טכניקה של מיקרוסקופיה intravital, תוארה לראשונה בשנת 1968. 8
אף על פי מודלים שונים של IRI (איסכמיה reperfusion פציעה) תוארו של איברים שונים, 9-12 רק מעטים מתאימים להדמיה ישירה של גיוס ליקוציט במיטה כלי הדם ברמה גבוהה של איכות התמונה. 8
אנחנו כאן לקדם את מיקרוסקופיה דיגיטלית epifluorescence intravital של ורדיד postcapillary ב microcirculation cremastericשל חולדה 13 כשיטה נוחה איכותית וכמותית לנתח גיוס ליקוציט לחקר-IRI ברקמת השריר מפוספס ולספק מדריך מפורט עבור להשיג את הטכניקה. בנוסף, אנו מדגימים ממכשולים נפוצים ולספק עצות שימושיות אשר צריך לאפשר לקורא להעריך באמת, ובטוח לבצע את השיטה.
בשלב ידי פרוטוקול צעד שאנו מתארים כיצד להתחיל עם הרדמה הנשימה מבוקרת תחת פיקוח מספיק כדי לשמור על בעל החיים מורדם היטב במשך תקופות זמן ארוכות יותר. לאחר מכן, אנו מתארים את הכנת cremasteric כסיד שטוח דק של רזולוציה אופטית יוצאת מן הכלל ולספק פרוטוקול הדמיה ליקוציט ב IRI כי כבר נקבעה גם במעבדות שלנו.
Protocol
Discussion
ליקוציט-האנדותל אינטראקציה, הייצור של מינים החמצן מגיב והפעלה של מערכת המשלים הם התכונות העיקריות של תפקוד לקוי של IRI הנגרמת לרקמה. 26 microcirculation הרקמה הפגועה נחשב כאתר נפרד עבור הופעת דלקת. מלבד הניסויים ב vivo לשעבר כגון קאמרית מבחני הזרימה 27, 28 זה חובה ל…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של "דויטשה Forschungsgemeinschaft" כדי SU Eisenhardt (EI 866/1-1).
Materials
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 – A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32×32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
Riferimenti
- Cetin, C. Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps. Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).
- Granger, D. N. Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).
- Lazarus, B. The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle. J Pathol. 191, 443-448 (2000).
- van den Heuvel, M. G. Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery. J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).
- Rosen, S. D. Cell surface lectins in the immune system. Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).
- van der Flier, A., Sonnenberg, A. Function and interactions of integrins. Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).
- Panes, J., Perry, M., Granger, D. N. Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention. Br. J. Pharmacol. 126, 537-550 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Sutton, T. A. Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).
- Serracino-Inglott, F. Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion. Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).
- Eppinger, M. J. Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung. Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).
- Dumont, E. A. Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart. Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Woeste, G. Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia. Transplantation. 86, 961-967 (2008).
- Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart. Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).
- Dobschuetz, E. v. o. n. Dynamic intravital fluorescence microscopy–a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis. Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).
- Vutskits, L. Adverse effects of methylene blue on the central nervous system. Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).
- Takasu, A. Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats. J. Trauma. 8, 312-316 (2010).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation. J. Vis. Exp. (52), e2874 (2011).
- Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle. Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).
- Leoni, G. Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion. FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).
- Simoncini, T. Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase. Nature. 407, 538-541 (2000).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Mori, N. Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice. Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).
- Eisenhardt, S. U. Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples. Ann. Plast. Surg. , (2011).
- Eisenhardt, S. U. Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents. Blood. 109, 3521-3528 (2007).
- Eisenhardt, S. U. Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques. Circ Res. 105, 128-137 (2009).
- Eisenhardt, S. U. C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties. Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).
- Granger, D. N. . Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion. , 520 (1995).
- Baatz, H. Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G. Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).
