Un sistema per<em> Ex vivo</emColtura> del pancreas embrionale

Summary

Qui, si descrive un metodo per l'isolamento, la cultura e manipolazione del pancreas embrionali di topo. Ciò rappresenta un ottimo<em> Ex vivo</emSistema> per studiare vari aspetti dello sviluppo del pancreas, tra cui la morfogenesi, la differenziazione e la crescita. Espianti gemma del pancreas possono essere coltivate per diversi giorni e utilizzato in una vasta gamma di applicazioni diverse, tra cui tutto il supporto di immunofluorescenza e di imaging dal vivo.

Abstract

Il pancreas controlla le funzioni vitali del nostro corpo, compresa la produzione di enzimi digestivi e la regolazione dei livelli di zucchero nel sangue ^1. Anche se negli ultimi dieci anni molti studi hanno contribuito a una solida base per la comprensione organogenesi del pancreas, persistono importanti lacune nella nostra conoscenza della formazione pancreas primi ^2. Una comprensione completa di questi primi eventi si permettono di percepire lo sviluppo di questo organo, ma anche in materia di malattie incurabili che colpiscono il pancreas, come il diabete o il cancro del pancreas. Infine, questa informazione genererà un progetto per sviluppare terapie di sostituzione cellulare nel contesto del diabete.

Durante l'embriogenesi, il pancreas proviene da diverse escrescenze embrionali del endoderma foregut dorsale e ventrale al giorno embrionale (E) 9.5 in embrione di topo ^3,4. Entrambi escrescenze evaginate nel mesenchima circostante come solido epiteligemme l, che subiscono la proliferazione, la differenziazione e la ramificazione di generare un organo pienamente maturo ^2,5,6. Evidenze recenti hanno suggerito che la crescita e la differenziazione delle linee cellulari pancreatiche, comprese le producono insulina β-cellule, dipende dalla corretta tessuto-architettura, rimodellamento epiteliale e il posizionamento all'interno delle cellule dell'epitelio del pancreas ramificazione ^7,8. Tuttavia, come ramificazione morfogenesi si verifica ed è coordinata con la proliferazione e la differenziazione nel pancreas è in gran parte sconosciuto. Questo è in parte dovuto al fatto che le attuali conoscenze circa questi processi di sviluppo è basata quasi esclusivamente su analisi di campioni fissati, mentre gli eventi morfogenetici sono altamente dinamici.

Qui, si riporta un metodo per la dissezione e mouse coltura embrionale pancreatico gemme ex vivo su piatti fondo di vetro, che consentono la visualizzazione diretta del pancreas sviluppo (Figura 1). Questo cultoure sistema è idealmente concepito per microscopia confocale a scansione laser e, in particolare, live-cell imaging. Espianti pancreatiche può essere preparato non solo dal tipo selvatico embrioni di topo, ma anche da ceppi di topi geneticamente modificati (transgenici o knockout per esempio), che consente studi in tempo reale di fenotipi mutanti. Inoltre, questo sistema di coltura ex vivo è utile per studiare gli effetti dei composti chimici di sviluppo pancreatico, consentendo di ottenere dati quantitativi circa proliferazione e crescita, allungamento, ramificazione, tubulogenesis e differenziazione. In conclusione, lo sviluppo di un metodo ex pancreas cultura in vivo espianto combinato con imaging ad alta risoluzione fornisce una solida piattaforma per l'osservazione di eventi morfogenetici e la differenziazione che si verificano all'interno del embrione di topo in via di sviluppo.

Protocol

Il protocollo qui descritto è stato adattato dalla tecnica originariamente descritto in Percival e Slack 9 e ottimizzata per microscopia confocale. 1. Rivestimento di fondo di vetro piatti cultura I seguenti passaggi devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Espianti pancreatiche sono coltivate in 35 mm con piastre Petri da 20 mm di diametro in vetro di micropozzetti di fondo (ad esempio MatTek Co…

Discussion

Una volta che il destino del pancreas viene specificato, le cellule progenitrici del pancreas sottoposti proliferazione diffusa, differenziazione e morfogenesi per formare alla fine un organo maturo e funzionale ^2,4. Attualmente, come ramificazione avviene nel pancreas e come è collegata alla proliferazione e differenziazione progenitore è ampiamente sconosciuta. Culture espianto pancreatici rappresentano un sistema ideale per chiarire questi processi ex vivo ^5,9,11. Grazie alla combinaz…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Kept in sterile conditions
Cell culture grade water	PAA	S15-012	Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Fetal calf serum Gold	PAA	A15-151	Kept in sterile conditions
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	Kept in sterile conditions
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Kept in sterile conditions
4-well Multidishes	Nunc	176740
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde	Roth	0335.3	Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Watchmaker’s foreceps Dumont #5	Roth	K342.1