Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopia è un approccio efficace per osservare le strutture in prossimità della superficie cellulare ad elevato contrasto e risoluzione temporale. Abbiamo dimostrato come TIRF può essere utilizzato per studiare dinamica della proteina alla corteccia di cellule di cellule batteriche e fungine parete chiusi.
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Articolo metodologico
Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy
In questo articolo
Sommario
Abstract
Microscopia TIRF è emerso come una tecnologia di imaging potente per studiare spazio-temporali dinamica delle molecole fluorescenti in vitro e in cellule viventi 1. Il fenomeno ottico di riflessione interna totale si verifica quando la luce passa da un mezzo con alto indice di rifrazione in un mezzo con indice di rifrazione basso ad un angolo maggiore di un angolo caratteristica critica (cioè più vicino ad essere parallelo al confine). Sebbene tutta la luce viene riflessa in tali condizioni, una onda evanescente viene creato attraverso e che si propaga lungo il confine, che decade esponenzialmente con la distanza, e penetra solo aree campione che sono 100-200 nm prossimità dell'interfaccia 2. Oltre ad assicurare un'elevata risoluzione assiale, l'eccitazione ridotta di fluorofori fuoco crea un segnale molto alti rapporti di rumore e minimizza gli effetti dannosi di photobleaching 2,3. Essendo una tecnica widefield, TIRF permette anche più veloce di immagini acquisizione rispetto alla maggior parte di scansione in base configurazioni confocale.
A prima vista, la profondità di penetrazione basso TIRF sembra essere incompatibile con imaging di cellule batteriche e fungine, spesso circondati da pareti cellulari spesse. Al contrario, abbiamo scoperto che le pareti cellulari del lievito e cellule batteriche effettivamente migliorare la utilizzabilità di TIRF e aumentare la gamma di strutture osservabili 4-8. Molti processi cellulari possono quindi accedere direttamente TIRF in piccoli microrganismi unicellulari, che spesso offrono potenti tecniche di manipolazione genetica. Questo ci permette di eseguire esperimenti in biochimica in vivo, dove la cinetica delle interazioni proteiche e delle attività può essere valutato direttamente in cellule viventi.
Descriviamo qui le singole fasi necessarie per ottenere immagini di alta qualità per TIRF Saccharomyces cerevisiae o cellule di Bacillus subtilis. Segnaliamo vari problemi che possono Affect visualizzazione TIRF di sonde fluorescenti in cellule ed illustrare la procedura con esempi di applicazione diversi. Infine, abbiamo dimostrato come le immagini TIRF può essere ulteriormente migliorata utilizzando consolidate tecniche di restauro delle immagini.
Protocollo
1. Preparazione del campione
- Preparazione di vetrini coprioggetto
Coprivetrini deve essere pulito dalle particelle di polvere, come TIRF è sensibile ai segnali di fondo derivanti dalla coprioggetto (Fig. 1A, Movie 1).- Utilizzando pinze vetrini coprioggetto posto in un contenitore in ceramica con coperchio.
- Riempire il contenitore di vetro con 1 M NaOH (possono essere riutilizzati più volte).
- Incubare per 2 h in lenta rotazione continua (orbitale). Incubazione eccessiva (> 8 h) creerà scivola copertura opaca.
- Lavare due volte con acqua distillata per 5 minuti sotto lenta rotazione....
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Discussione
Microscopia TIRF è la tecnica di scelta per proteine di immagine periferici. La profondità bassa penetrazione del campo evanescente minimizza di luce fuori fuoco, che porta ad un ottimo segnale rispetto al rumore e consente di acquisizione dati con un frame rate elevati, o immagini di proteine espresse molto debolmente. La combinazione di un elevato contrasto e frame rate elevati microscopia TIRF rende uno strumento ideale per immagini dinamiche spazio-temporali di proteine localizzate corticale. È interessante no.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Max Planck Society.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome dello strumento / reagente | Tipo | Azienda | Numero di catalogo |
| Orbital Shaker | Strumento | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER |
| TIRF microscopio | Fino a | Configurazione personalizzata | |
| Contenitore di vetro | Strumento | Vitlab | 340-232880353 |
| Rastrello di colorazione Ceramic | Strumento | Sci Thomas. | 8542E40 |
| Concanavalina A | Reagente | Sigma | L7647 |
| Coprivetrini # 1 (18 x 18 mm) | Microscopio | Menzel Gläser | BB018018A1 |
| Vetrini | Microscopio | Menzel Glaser | AA00000102E |
| Olio di immersione | Microscopio | Zeiss | Immersol 518F |
| Agarosio | Reagente | Invitrogen | 16500-500 |
| FluoSpheres | Reagente | Invitrogen | F8795 |
Riferimenti
- Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
- Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
- Axelrod, D.
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Ristampe e permessi
