نحن وصفا لفحص مراسل مضان على التعرف بسرعة وتوصيف الجينات التي تنظم الماوس الخلايا الجذعية الجنينية وصيانة وتجديد النفس.
تعدد القدرات الذاتية والتجديد هما الخصائص المميزة للخلايا الجذعية الجنينية (خلايا ES). وفهم الآلية الجزيئية الكامنة وراء يسهل إلى حد كبير على استخدام خلايا ES لدراسات البيولوجيا التطورية، والنمذجة المرض، واكتشاف المخدرات، والتجدد الطب (استعرضت في 1،2).
إلى الإسراع في تحديد وتوصيف المنظمين رواية من خلية وفاق وصيانة النفس التجديد، قمنا بتطوير مضان مراسل القائم على فحص لقياس كمي لوضع الذات في تجديد خلايا ES فأر باستخدام خلايا Oct4GiP 3. الخلايا Oct4GiP تعبر عن ببروتين أخضر (GFP) في إطار السيطرة على المنطقة الجين المروج Oct4 4،5. مطلوب Oct4 لخلية ES الذاتي تجديد، ويعبر عنه بشكل كبير في الخلايا وفاق وسرعان ما انهارت التنظيم خلال التمايز 6،7. ونتيجة لذلك، GFP التعبير ومضان في الخلايا مراسل يرتبط بأمانةمع وفاق هوية الخلية 5، ومضان تنشيط الخلايا ويمكن فرز (FACS) يمكن استخدام التحليل أن تراقب عن كثب الوضع الذاتي تجديد الخلايا على مستوى خلية واحدة 3،8.
مقرونا رني، يمكن استخدام الفحص مراسل Oct4GiP إلى التعرف بسرعة ودراسة المنظمين من صيانة الخلية وفاق والذاتي تجديد 3،8. بالمقارنة مع الطرق الأخرى لمعايرة الذاتي تجديد، وهو أكثر ملاءمة، الحساسة، والكمية، وأقل تكلفة. ويمكن القيام بها في 96 – أو 384 كذلك لوحات لدراسات واسعة النطاق مثل شاشات عالية الإنتاجية أو وراثية تحليل قشوة. أخيرا، وذلك باستخدام خطوط أخرى ES مراسل خلية نسب محددة، ويمكن أيضا للفحص وصفنا هنا يمكن تعديلها لدراسة مواصفات مصير خلال تمايز الخلايا ES.
لا يمكن للمقايسة مراسل Oct4GiP وصفنا أعلاه قياس كميا مدى التجديد الذاتي مقابل التمايز. بالمقارنة مع الطرق الأخرى المتاحة، مثل ال 12 مورفولوجيا القاعدة والانتشار / البقاء القائم على المقايسات، فإنه يوفر أعلى حساسية والإنتاجية، فضلا عن قياس أكثر مباشرة للدولة وفاق ?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر براد Lackford لقراءة وتحرير مخطوطة. وأيد هذا البحث من قبل المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية، المعاهد الوطنية للصحة برنامج بحوث ضمن الجدران Z01ES102745 (إلى GH).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
ESGRO complete plus clonal grade medium | Millipore | SF001-500P |
DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 |
OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 |
ESGRO mLIF (107 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 |
MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 |
100x Nucleosides for ES cell | Millipore | 10620-1 |
2-mercaptoethanol | Sigma | M7522-100ml |
ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 |
Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 |
Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 |
Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 |
Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5′-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon.