Oct4GiP Reporter Assay til at studere gener, der regulerer mus embryonale stamceller Vedligeholdelse og Self-fornyelse
Summary
Beskriver vi en fluorescens Reporter Assay til hurtigt at identificere og karakterisere gener, der regulerer muse embryonale stamceller vedligeholdelse og selvfornyelse.
Abstract
Pluripotency og selv-fornyelse er to definerende karakteristika af embryonale stamceller (ES-celler). Forstå den underliggende molekylære mekanisme vil i høj grad lette brugen af ES-celler for Developmental Biology undersøgelser, sygdom modellering, Drug Discovery, og regenerativ medicin (revideret i 1,2).
At fremskynde identifikation og karakterisering af hidtil ukendte regulatorer af ES-celle vedligeholdelse og selvfornyelse, udviklede vi en fluorescens reporter-baseret assay til kvantitativt at måle selvfornyelse status i muse ES-celler under anvendelse af Oct4GiP cellerne tre. De Oct4GiP celler udtrykker det grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af Oct4 genpromotorregion 4,5. Oct4 kræves for ES-celle selvfornyelse, og er overudtrykt i ES-celler og hurtigt nedreguleres under differentiering 6,7. Som et resultat korrelerer GFP-ekspression og fluorescens i reportergen-celler nøjagtigtmed ES-celle identitet 5, og fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS)-analyse kan bruges til nøje at overvåge selvfornyelse status af cellerne på enkelt celle niveau 3,8.
Sammen med RNAi, kan Oct4GiP reporter analysen bruges til hurtigt at identificere og studere regulatorer af ES-celle vedligeholdelse og selvfornyelse 3,8. Sammenlignet med andre fremgangsmåder til assaybestemmelse selvfornyelse, er det mere bekvemt, følsom, kvantitativ, og lavere omkostninger. Det kan udføres på 96 – eller 384-brønds plader for omfattende undersøgelser, såsom høj-throughput skærme eller genetisk epistasis analyse. Endelig, ved hjælp af andre slægt-specifikke reporter ES-cellelinier, kan assayet er beskrevet her også modificeres til at studere skæbne specifikation i ES-celle-differentiering.
Protocol
Discussion
Den Oct4GiP reporter analysen beskriver vi ovenfor kan kvantitativt måle omfanget af selvfornyelse vs differentiering. Sammenlignet med andre tilgængelige metoder, såsom morfologi-baserede 12 og proliferation / levedygtighed-baserede assays, giver det højere følsomhed og gennemløb, såvel som en mere direkte måling af ES-celle tilstand. Det er derfor velegnet til store skærme og genetiske epistasis analyse. Faktisk har vi og andre med succes brugt Oct4GiP reporter analysen for genom-dækkende RNAi sk?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Brad Lackford til læsning og redigering af manuskriptet. Denne forskning blev støttet af National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Egne Research Program Z01ES102745 (til GH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | Millipore | SF001-500P |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 |
| 100x Nucleosides for ES cell | Millipore | 10620-1 |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522-100ml |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 |
Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5′-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon.
Riferimenti
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs–triggers of gene silencing–into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
