Oct4GiP Ensaio Reporter para o Estudo de genes que regulam o mouse Manutenção células-tronco embrionárias e auto-renovação
Summary
Nós descrevemos um ensaio repórter de fluorescência para rapidamente identificar e caracterizar genes que regulam a manutenção do mouse células-tronco embrionárias e auto-renovação.
Abstract
Pluripotência e auto-renovação são duas características definidoras das células-tronco embrionárias (células ES). O entendimento do mecanismo molecular vai facilitar muito o uso de células-tronco embrionárias para estudos de biologia do desenvolvimento, modelagem de doenças, descoberta de drogas e da medicina regenerativa (revisto em 1,2).
Para acelerar a identificação e caracterização de novos reguladores de manutenção de células ES e auto-renovação, foi desenvolvido um ensaio baseado em fluorescência repórter para medir quantitativamente o estado de auto-renovação em células ES de rato usando as células Oct4GiP 3. As células Oct4GiP expressar a proteína verde fluorescente (GFP), sob o controlo da região promotora do gene Oct4 4,5. Oct4 é necessária para a célula ES auto-renovação, e é altamente expressa em células ES e rapidamente para baixo-regulado durante a diferenciação 6,7. Como resultado, a GFP expressão e de fluorescência nas células repórter correlaciona fielmentecom a célula de identidade ES 5, e fluorescência-activated separação de células (FACS) análise pode ser usado para acompanhar de perto o estado de auto-renovação das células ao nível única célula 3,8.
Juntamente com RNAi, o ensaio repórter Oct4GiP pode ser usada para rapidamente identificar e estudar os reguladores de manutenção de células ES e auto-renovação 3,8. Em comparação com outros métodos para ensaiar a auto-renovação, é mais conveniente, sensível, quantitativa, e de menor custo. Ela pode ser realizada em 96 – ou 384-bem placas para estudos em larga escala, tais como de alto rendimento telas ou de análise de epistasia genética. Finalmente, por meio de outros linhagem específicos repórter linhas de células ES, o ensaio descrevemos aqui também pode ser modificada para estudar especificação destino durante a diferenciação de células ES.
Protocol
Discussion
O ensaio repórter Oct4GiP descrevemos acima pode medir quantitativamente o grau de auto-renovação vs diferenciação. Em comparação com outros métodos disponíveis, tais como o 12 baseada na morfologia e proliferação / viabilidade baseado ensaios, oferece uma maior sensibilidade e rendimento, bem como uma medição mais directa do estado de células ES. É, portanto, bem adequado para grande escala telas e análise epistasia genética. Na verdade, nós e os outros têm utilizado com sucesso o ensaio r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Brad Lackford para leitura e edição do manuscrito. Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental, National Institutes of Health Research Program intramuros Z01ES102745 (GH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | Millipore | SF001-500P |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 |
| 100x Nucleosides for ES cell | Millipore | 10620-1 |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522-100ml |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 |
Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5′-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon.
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