Oct4GiP Reporter analys för att studera gener som reglerar Mouse embryonala Underhåll Stem Cell och självförnyelse
Summary
Vi beskriver en fluorescens reporter analys att snabbt identifiera och karakterisera gener som reglerar musen embryonala underhåll stamceller och själv-förnyelse.
Abstract
Pluripotens och självförnyelse är två utmärkande egenskaper hos embryonala stamceller (ES-celler). Förstå den underliggande molekylära mekanismen kommer i hög grad underlätta användningen av ES-celler för utvecklingsbiologi studier, sjukdom modellering, läkemedelsutveckling och regenerativ medicin (över 1,2).
För att påskynda identifiering och karakterisering av nya regulatorer av ES-celler underhåll och självförnyelse, utvecklade vi en fluorescens reporter-baserad analys för att kvantitativt mäta självförnyelse status i mus ES-celler med hjälp av Oct4GiP cellerna 3. De Oct4GiP celler uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av den Oct4 genpromotorregionen 4,5. Oct4 krävs för ES-cell självförnyelse och är mycket uttrycks i ES-celler och snabbt nedregleras under differentiering 6,7. Som ett resultat korrelerar GFP-uttryck och fluorescens i rapportörgenanalysen celler trogetmed ES cellidentitet 5, och fluorescens-cellsortering (FACS) kan analysen användas för att noga övervaka självförnyelse status cellerna vid den enda cellnivå 3,8.
Tillsammans med RNAi kan Oct4GiP reporter analysen användas för att snabbt identifiera och studera regulatorer av ES-celler underhåll och självförnyelse 3,8. Jämfört med andra metoder för analys av självförnyelse, är det mer praktiskt, känslig, kvantitativ, och lägre kostnad. Den kan utföras i 96 – eller 384-brunnars plattor för omfattande undersökningar, såsom hög genomströmning skärmar eller genetisk epistasis analys. Slutligen, genom användning av andra härstamning-specifika reportern ES-cellinjer kan analysen som beskrivs här också modifieras för att studera ödet specifikation under ES-celldifferentiering.
Protocol
Discussion
Den Oct4GiP reporter analysen beskriver vi ovan kan kvantitativt mäta omfattningen av självförnyelse vs differentiering. Jämfört med andra tillgängliga metoder, såsom morfologi-baserade 12 och proliferation / viabilitet-baserade analyser, erbjuder den högre känslighet och genomströmning, såväl som en mer direkt mätning av ES-cellen tillstånd. Det är därför väl lämpad för storskaliga skärmar och genetisk epistasis analys. I själva verket har vi och andra använts framgångsrikt analysen O…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Brad Lackford för att läsa och redigera manus. Denna forskning stöds av National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Interna Research Program Z01ES102745 (till GH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | Millipore | SF001-500P |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 |
| 100x Nucleosides for ES cell | Millipore | 10620-1 |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522-100ml |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 |
Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5′-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon.
Riferimenti
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs–triggers of gene silencing–into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
