Bir floresan<em> In situ</em> Hibridizasyon (FISH) yöntemi görsel floresan mikroskobu kullanarak viral genomik RNA algılamak için geliştirilmiştir. Bir prob daha sonra hibridizasyon ve immünfloresan teknikleri bir arada kullanarak tespit edilebilir viral RNA özgüllük ile yapılır. Bu teknik, hücre içi virüs kaçakçılık olaylarının kontrolü hakkında bilgi veren, kararlı durumda viral RNA veya DNA'nın yerelleştirme belirleme avantajı sunuyor.
Hücrelerin viral replikasyon için enerji ve kaynak aktarmak için hizmet normal hücre fonksiyonları belirli değişiklikler ortaya çıkarmak etkileyecek virüsler. Konak hücre fonksiyonunda birçok açıdan genellikle viral gen ürünlerinin ifadesi ile, virüsler tarafından el edilmektedir işe konak hücre proteinleri ve makine bu. Ayrıca, mobil veziküller ve motor proteinleri virüs mühendisi spesifik membran organelleri veya etiket hücre (de novo enfeksiyon sırasında, virüslerin eş-opt moleküler motor protein çekirdeğinin hedef bölgeleri hedeflemek; sonra, virüs montaj sırasında, onlar hücresel kaçırmak olacaktır ) virüslerin mecliste yardımcı olacak makine. Daha az virüsler, özellikle de RNA genomu olan, protein ve RNA bileşenleri her ikisinin intraselüler ticareti koordine ve bunlar, hücre özel lokuslar bulaşıcı parçacıklar montaj elde nasıl nasıl anlaşılmaktadır. RNA yerelleşme çalışmada daha önceki çalışmaları başladı. Düşük ökaryotik em geliştirilmesibryos ve nöronal hücrelerin önemli biyolojik bilgiler, hem de gen ekspresyonu şelaleden oluşan programlama RNA yerelleşmenin önemi vurgulamıştır. Diğer organizmalar ve hücre sistemleri çalışmada da benzer önemli bilgiler vermiştir. Virüsler zorunlu parazitlerdir ve çoğaltmak için bunların ana hücre kullanmalıdır. Bu nedenle, RNA virüsleri döl virüs partikülleri 1 içine sitoplazma yoluyla ve nihai varış noktalarından biri nükleer gözenek yoluyla nükleus,,, kendi RNA genomu yönlendirmek anlamak önemlidir.
BALIK viral RNA kararlı durum lokalizasyon değişiklikleri tanımlamak için yararlı bir araç olarak hizmet vermektedir. Co-analiz viral RNA 3 ile proteinlerin ortak lokalizasyon hakkında bilgi sağlayacak IF immunfloresan (IF) analizi 22, FISH ile / birleştirildiği zaman. Bu analiz, bu nedenle diğer biyokimyasal ve biyofiziksel olarak, RNA-protein etkileşimleri test etmek için iyi bir başlangıç noktası sağlarkendisi tarafından eş-lokalizasyon yana 4,5 testler, bir etkileşim belli olması için yeterli kanıt değildir. Böyle bir yöntemi kullanarak viral RNA yerelleştirme incelerken, bol bilgi viral ve hücresel RNA kaçakçılığı olayları 6 hem de elde edilmiştir. Örneğin, HIV-1 hücre çekirdeğine RNA üretir, ancak, sadece RNA sitoplazmadaki tercüme edilir. bir anahtar viral proteini eksik (Rev) 7, viral RNA'nın BALIK viral için blok çekirdeği 8'de HIV-1 genomik RNA'nın retansiyon bağlı olduğunu ortaya çıkarmıştır.
Burada, in situ viral genom RNA 'nın görsel analizi için yöntem sunmaktadır. Yöntem bir etiketli RNA prob yararlanır. Bu prob viral genom RNA tamamlayıcı olacak şekilde tasarlanmıştır. Boyunca antisens RNA prob, digoxigenin (DIG) ile değiştirilmiştir ribonukleotid in vitro sentezinde vitro transcr bir dahildiription reaksiyon. Prob hücreleri hedef RNA ile melezleştirilebilir sonra BALIK / IF gerçekleştirirken, daha sonra antikorun etiketleme adım (Şekil 1) mRNA Lokalizasyon gibi ilgi proteinleri ortaya çıkaracaktır.
BALIK / co-analizler IF şimdi 9,15,16 rafine edilmiş hücrelerde viral RNA görselleştirmek için güvenilir bir yöntemdir. Birkaç yıl boyunca, biz RNA için boyama zarif bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, prob hedef RNA 17 özgü sağlanan hücre tipleri arasında geniş bir yelpaze üzerinde kullanılabilmektedir. DIG ile etiketlenmesi prob olarak, bu basit bir boyama ile RNA görselleme yeteneğine sahiptirler. RNA ve diğer proteinler için boyama birleştirildiğinde, BALIK / IF co-analizler hücresel yapılar ve protein / RNA lokalizasyon gözlemlemek için güçlü bir araç haline gelir.
RNA tespit özgüllük oldukça yüksektir. Bu, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Rev eksikliği çekirdeğinde 18 viral RNA tuzağa tespit viral genomik RNA lokalizasyonu, BALIK odaklanmış özgün çalışma bazılarında. Bu yana, viral genomik RNA lokalizasyonuna bol yeni bilgiler techniqu kullanılarak elde edilmiştire burada özetlenen. Eksprese eden hücresel protein tarafından, belirli bir popülasyonları-değil, viral RNA'nın her bir hücrenin farklı bölgelere lokalize etmek için zorlanır. HnRNP A2 siRNA tarafından boşaldığında fenotipi benzer UHP ekspresyonu, elde edilen HIV-1-salgılayan hücrelerin 13 RNA gözle MTOC birikmeye neden olur. (Hücresel perifere hücre içi etki viral genomik RNA sürümde dynein ağır zincir 1 sonuç p50/Dynamitin aşırı veya demonte: viral genomik RNA eksi uç motor protein, dynein devre dışı bırakarak hücre perifere itilebilir Şekil 2). Artık aktif juxtanuclear etki lokalize çünkü artık dynein motoru bağlar UHP, RILPΔN, bir mutant, dağılır sitoplazmaya (LAMP1 tarafından etiketlenir) endozomlar. Bu sonuçlar, HIV-1 genomik RNA ve özellikle de bir plastik nüfusun kavramı işaret ettiği, HIV-1 genomik farklı havuzlarıViral replikasyon döngüsünde bazen tanımlanabilen rolleri ile var RNA. Bunlar aynı kavramlar zaten bu mRNA, Gag 19 tarafından kodlanan proteinin tespit edilmiştir.
BALIK / antikor seçimi ve yer durumu ile ilgili ortak analizler IF kullanımlarına sınırlamalar vardır. Primer ve sekonder antikorlar ve bunların konsantrasyonları, en iyi kombinasyonu optimizasyonu (Tablo 1 ve 2) optimize etmek zaman alacaktır. Büyük şirketler tarafından hibridomlar yapılan veya üretilen antikorlar 01:02 dan 1:2000 her yerde değişir, fakat en iyi sonuç için üretici tarafından sağlanan yönergelere emin olun konsantrasyonları olabilir. Antikorun üretildiği ev sahibi, aynı zamanda dikkat edilmesi gerekir. Keçi antikorları ile karıştırılarak koyun da çapraz türleri tanıma (veriler gösterilmemiştir) nedeniyle yüksek arka planda bu kombinasyon sonucu olarak birincil ve ikincil antikor kaçınılmalıdır. Alexa-Fluor orta dereceli içinry antikorlar, konsantrasyon set hemen hemen herhangi bir antikor 1:500 de kullanılabilir. Bu raporda açıklanan BALIK / co-analizleri IF diğer dezavantajı hücreler tespit ve formaldehit ve deterjan (Şekil 1) kullanarak permeabilize edilmiştir sonra, kararlı durumda olan yerde RNA yakalar olduğunu.
Ancak, canlı hücrelerde RNA görüntüleme çoğunlukla gibi GFP gibi floresan proteinleri tarafından etiketlenir viral RNA genomu varyasyonları kullanarak, aracı 20-22 çeşitli yoluyla elde edilmiştir. Bununla birlikte, canlı hücreler içinde RNA Lokalizasyon tanımlamak için ek aracı yüzey devam eder. Bu yeni yöntemler Ispanak 23, 24 vasıtası SNAP veya MTRIP 2 tarafından etiketleme RNA içerir. Bu teknikler aynı zamanda bir parçası mikroskop ile mRNA tespit amacıyla mRNA etiketlemek için tasarlanmış olması gerektiğini yüzeylerde eklemeden önce veya hücre geçirgenliği gereksinimi de dahil olmak üzere birkaç dezavantajları muzdarip. Gerçekten de, büyük AdvaBu raporda özetlenen FISH analiz ntage yerli RNA en fizyolojik ilgili sonuçlara yol değişmeden olduğu gerçeği yatıyor.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar metodolojinin geliştirilmesine katkıları için laboratuar geçmiş ve mevcut üyelerin tavsiyesi için buraya ve Alan Cochrane özetlenen teşekkür ederim. LA Fraser, Monat ve MacPherson Kariyer Ödülü tarafından desteklenen Sağlık Araştırması (CIHR) Doktora Bursu ve AJM Kanadalı bir Enstitüleri bir alıcı olduğunu. Bu çalışma CIHR (hibe # MOP-56.974) bir hibe ile desteklenmektedir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.