En électroporation in ovo dans Mésencéphale Poussin pour étudier la fonction des gènes dans le développement neurone dopaminergique
Summary
Pour évaluer la fonction et la régulation des gènes lors du développement des neurones dopaminergiques du mésencéphale, nous décrivons une méthode qui consiste à<em> In ovo</emÉlectroporation> des constructions d'ADN plasmidique en embryonnaires progéniteurs chiches mésencéphale ventral de neurones dopaminergiques. Cette technique peut être utilisée pour obtenir une expression efficace des gènes d'intérêt pour étudier différents aspects du développement du mésencéphale et la différenciation des neurones dopaminergiques.
Abstract
Les neurones dopaminergiques situés dans le mouvement de lutte mésencéphale ventral, le comportement affectif, et les mécanismes de récompense 1-3. Le dysfonctionnement de la ventrale du mésencéphale dopaminergique neurones est impliquée dans la maladie de Parkinson, la schizophrénie, la dépression et la démence 1-5. Ainsi, l'étude de la régulation de la différenciation des neurones dopaminergiques du mésencéphale pourrait non seulement fournir des indications importantes sur les mécanismes régulant le développement des neurones du mésencéphale et la spécification sort géniteur, mais aussi aider à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter une variété de troubles neurologiques de l'homme.
Les neurones dopaminergiques différencier de progéniteurs neuronaux qui bordent la zone ventriculaire du mésencéphale ventral embryonnaire. Le développement des progéniteurs neuronaux est contrôlé par des programmes d'expression génique 6,7. Nous rapportons ici les techniques qui utilisent l'électroporation pour exprimer des gènes spécifiquement dans le mésencéphale de Hamburger Hamilton (HH) étape 11 (esomites irteen, 42 heures) les embryons de poulet 8,9. Le développement externe d'embryons de poulet permet de pratiques spécifiques à des manipulations expérimentales stades embryonnaires, avec des effets déterminés à des moments plus tard, de développement 10-13. Poussin tubes neuraux embryonnaires antérieures à l'étape SA 13 (dix-neuf somites, 48 heures) sont constitués de cellules progénitrices neurales pluripotentes qui sont capables de se différencier en cellules types distincts du système nerveux. Le vecteur pCAG, qui contient à la fois un promoteur CMV et un poussin β-actine enhancer, permet l'expression robuste de drapeau ou d'autres constructions épitope-étiquette dans des tubes de poulet embryonnaires neurales 14. Dans ce rapport, nous insistons sur les mesures spéciales pour parvenir à l'expression des gènes au niveau régional restreint dans embryonnaires du mésencéphale progéniteurs neuronaux dopaminergiques, y compris comment injecter de l'ADN construit spécifiquement dans la région du mésencéphale embryonnaire et comment repérer électroporation avec de petites électrodes sur-mesure. Analyser cmésencéphale hick à des stades ultérieurs fournit une excellente système di vivo pour plasmide vecteur à médiation de gain de fonction et de la perte de fonction des études de développement mésencéphale. Modification du système expérimental peut prolonger le test à d'autres parties du système nerveux pour effectuer une analyse de cartographie et d'enquêter sur le sort de la régulation de l'expression génique.
Protocol
Discussion
Le électroporation in ovo de mésencéphale embryonnaire de poulet offre un faible coût et alternative rapide à la génération d'animaux transgéniques ou knock-out pour effectuer une étude in vivo des fonctions des gènes dans le mésencéphale neurone dopaminergique développement. Utilisation à court de 2 mm des électrodes de platine longues en forme de L avec injection d'ADN embryonnaire mésencéphale spécifique est la clé pour parvenir à une expression efficace du gène…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Takahiko Matsuda pour fournir le pCAG-mCherry construire. YCM est soutenu par une bourse de développement de carrière de la Fondation Schweppe et une subvention de la Fondation Whitehall.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
Riferimenti
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