ドーパミン作動性ニューロンの開発における遺伝子機能を研究するためのニワトリ中脳でのOVOエレクトロポレーションに
Summary
機能や中脳ドーパミン作動性ニューロンの開発中の遺伝子の調節を評価するために、我々は、関与の方法について説明します。<emOVOで></emニワトリ胚腹側中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞にプラスミドDNAコンストラクト>エレクトロポレーション。この手法は、脳の発達とドーパミン作動性ニューロンへの分化のさまざまな側面を研究する目的遺伝子の効率的な発現を達成するために使用することができます。
Abstract
腹側中脳のコントロールの動きにありますドーパミン作動性ニューロン、感情的な動作、および報酬のメカニズム1-3。腹側中脳ドーパミン作動性ニューロンの機能不全は、パーキンソン病、統合失調症、うつ病、認知症1-5に関与している。したがって、中脳ドーパミン作動性ニューロンの分化の調節を研究することだけ脳の開発と神経前駆細胞の運命仕様を制御するメカニズムに重要な洞察を提供することができませんでしたが、また人間の神経疾患の様々を治療するための新たな治療戦略の開発に役立つ。
ドーパミン作動性ニューロンは、胚腹側中脳の脳室帯の内側を覆う神経前駆細胞から分化する。神経前駆細胞の開発は、6,7の遺伝子発現プログラムによって制御されます。ここでは、（目のハンバーガーハミルトン（HH）ステージ11の脳に特異的に遺伝子を発現するエレクトロポレーションを利用する技術を報告するirteen体節、42時間）ニワトリ胚8,9。ニワトリ胚の外部の開発は、後の発達時点10月13日で決定の影響で、特定胚の段階で便利な実験操作が可能になります。以前のHHステージ13（19体節、48時間）以上のニワトリ胚神経管、神経系の異なる細胞型に分化することができる多能性神経前駆細胞で構成されています。 CMVプロモーターおよびニワトリβ-アクチンエンハンサーの両方が含まれていますpCAGベクトルは、旗やニワトリ胚神経管14内の他のエピトープタグ付き構造体の強い発現が可能になります。本稿では、DNAは胚の中脳領域に特異的に構築し、どのように小さなカスタムメイドの電極をエレクトロポレーションを特定するために注入する方法など、胚の中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞に地域制限の遺伝子発現を達成するための特別措置を強調しています。 Cの分析後の段階で田舎者の脳は、脳開発のプラスミドベクターによるゲインの関数と機能喪失研究のための生体システムに優れた提供しています。実験システムの変更が運命マッピング解析を実行するために、遺伝子発現の調節を調べるための神経系の他の部分に分析を拡張することができます。
Protocol
Discussion
ニワトリ胚中脳の卵エレクトロポレーションで中脳ドーパミン作動性ニューロンの開発に遺伝子機能のin vivo試験で実行するトランスジェニックやノックアウト動物の世代に、低コストかつ迅速な代替手段を提供しています。胚の中脳特異的DNAインジェクションと一緒に短い2ミリメートル長いL字型の白金電極を使用すると、中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々はpCAG-mCherryが構築提供するために博士隆彦松田に感謝します。 YCMはSchweppe財団からのキャリア開発賞とホワイトホール財団からの助成金によってサポートされています。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
Riferimenti
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