I ovo elektroporering i Chick mitthjärnan för att studera genfunktion av dopaminerg Neuron utveckling
Summary
För att bedöma funktionen och regleringen av gener under utvecklingen av mitthjärnedopaminerga neuroner, beskriver vi en metod som innebär att<em> I ovo</em> Elektroporering av plasmid-DNA-konstruktioner i embryonala chick ventrala mitthjärnedopaminerga neuron föregångare. Denna teknik kan användas för att uppnå effektiv expression av gener av intresse att studera olika aspekter av mitthjärnan utveckling och dopaminerg neuron differentiering.
Abstract
Dopaminerga neuron belägna i ventrala mitthjärnan kontrollerar rörelser, emotionell beteende och mekanismer belöning 1-3. Den dysfunktion av ventrala mitthjärnan dopaminerga nervceller är inblandad i Parkinsons sjukdom, schizofreni, depression och demens 1-5. Således kunde studera regleringen av mitthjärnan dopaminerg neuron differentiering inte bara ge viktig insikt i mekanismer som reglerar mitthjärnan utveckling och neurala stamfader öde specifikation, men också hjälpa till att utveckla nya terapeutiska strategier för behandling av olika mänskliga neurologiska sjukdomar.
Dopaminerga neuroner skilja från neurala stamceller som kantar den ventrikulära zonen embryonala ventrala mitthjärnan. Utvecklingen av neurala stamceller styrs av program genuttryck 6,7. Här rapporterar vi som utnyttjar elektroporation att uttrycka gener specifikt i mitthjärnan på Hamburger Hamilton (HH) steg 11 (thirteen somiter, 42 timmar) kycklingembryon 8,9. Den extern utveckling av kycklingembryon möjliggör bekväma experimentella manipulationer vid specifika embryonala stadier, med de effekter som fastställs på senare utvecklingsstadier tidpunkter 10-13. Chick embryonala neurala rör tidigare än HH stadium 13 (nitton somiter, 48 timmar) består av multipotenta neurala stamceller som kan differentiera till olika celltyper i nervsystemet. Den pCAG vektor, vilken innehåller både en CMV-promotor och en kyckling β-aktin-förstärkaren, medger stabil expression av flagga eller annan epitop-märkta konstruktionerna i embryonala kycklingembryon neurala rören 14. I denna rapport betonar vi speciella åtgärder för att uppnå regionalt begränsad genuttryck i embryonala mitthjärnedopaminerga neuron föregångare, bland annat hur du ska injicera DNA-konstruktioner bestämt i den embryonala mitthjärnan regionen och hur man precisera elektroporation med små skräddarsydda elektroder. Analys chick mitthjärnan i senare skeden tillhandahåller en utmärkt in vivo-system för plasmidvektor-medierad förstärkning-av-funktion och förlust-av-funktionsstudier av mitthjärnan utveckling. Ändring av det experimentella systemet kan förlänga analysen till andra delar av nervsystemet för att utföra analyser öde kartläggning och för att undersöka regleringen av genuttryck.
Protocol
Discussion
In ovo elektroporering av embryonala kycklingen mitthjärnan ger en låg kostnad och snabbt alternativ till alstring av transgena eller knockout djur för att utföra in vivo-studie av genfunktioner i mitthjärnan dopaminerg neuron utveckling. Med användning av kort 2 mm långa L-formad platinaelektroder med embryonala mitthjärnan-specifik DNA-injektion är nyckeln för att uppnå effektiv expression av genen av intresse i mitthjärnedopaminerga neuron progenitorer. Dessutom, med användning av korre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Takahiko Matsuda för att tillhandahålla den pCAG-mCherry konstruktet. YCM stöds av ett Career Development Award från Schweppe Foundation och bidrag från Whitehall Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
Riferimenti
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with ‘reward’. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson’s disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. ‘Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
