För att bedöma funktionen och regleringen av gener under utvecklingen av mitthjärnedopaminerga neuroner, beskriver vi en metod som innebär att<em> I ovo</em> Elektroporering av plasmid-DNA-konstruktioner i embryonala chick ventrala mitthjärnedopaminerga neuron föregångare. Denna teknik kan användas för att uppnå effektiv expression av gener av intresse att studera olika aspekter av mitthjärnan utveckling och dopaminerg neuron differentiering.
Dopaminerga neuron belägna i ventrala mitthjärnan kontrollerar rörelser, emotionell beteende och mekanismer belöning 1-3. Den dysfunktion av ventrala mitthjärnan dopaminerga nervceller är inblandad i Parkinsons sjukdom, schizofreni, depression och demens 1-5. Således kunde studera regleringen av mitthjärnan dopaminerg neuron differentiering inte bara ge viktig insikt i mekanismer som reglerar mitthjärnan utveckling och neurala stamfader öde specifikation, men också hjälpa till att utveckla nya terapeutiska strategier för behandling av olika mänskliga neurologiska sjukdomar.
Dopaminerga neuroner skilja från neurala stamceller som kantar den ventrikulära zonen embryonala ventrala mitthjärnan. Utvecklingen av neurala stamceller styrs av program genuttryck 6,7. Här rapporterar vi som utnyttjar elektroporation att uttrycka gener specifikt i mitthjärnan på Hamburger Hamilton (HH) steg 11 (thirteen somiter, 42 timmar) kycklingembryon 8,9. Den extern utveckling av kycklingembryon möjliggör bekväma experimentella manipulationer vid specifika embryonala stadier, med de effekter som fastställs på senare utvecklingsstadier tidpunkter 10-13. Chick embryonala neurala rör tidigare än HH stadium 13 (nitton somiter, 48 timmar) består av multipotenta neurala stamceller som kan differentiera till olika celltyper i nervsystemet. Den pCAG vektor, vilken innehåller både en CMV-promotor och en kyckling β-aktin-förstärkaren, medger stabil expression av flagga eller annan epitop-märkta konstruktionerna i embryonala kycklingembryon neurala rören 14. I denna rapport betonar vi speciella åtgärder för att uppnå regionalt begränsad genuttryck i embryonala mitthjärnedopaminerga neuron föregångare, bland annat hur du ska injicera DNA-konstruktioner bestämt i den embryonala mitthjärnan regionen och hur man precisera elektroporation med små skräddarsydda elektroder. Analys chick mitthjärnan i senare skeden tillhandahåller en utmärkt in vivo-system för plasmidvektor-medierad förstärkning-av-funktion och förlust-av-funktionsstudier av mitthjärnan utveckling. Ändring av det experimentella systemet kan förlänga analysen till andra delar av nervsystemet för att utföra analyser öde kartläggning och för att undersöka regleringen av genuttryck.
In ovo elektroporering av embryonala kycklingen mitthjärnan ger en låg kostnad och snabbt alternativ till alstring av transgena eller knockout djur för att utföra in vivo-studie av genfunktioner i mitthjärnan dopaminerg neuron utveckling. Med användning av kort 2 mm långa L-formad platinaelektroder med embryonala mitthjärnan-specifik DNA-injektion är nyckeln för att uppnå effektiv expression av genen av intresse i mitthjärnedopaminerga neuron progenitorer. Dessutom, med användning av korre…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Takahiko Matsuda för att tillhandahålla den pCAG-mCherry konstruktet. YCM stöds av ett Career Development Award från Schweppe Foundation och bidrag från Whitehall Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
India ink | Staples | Filter 20% before use | |
Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |