באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום
Summary
המתואר כאן טכניקה כיום בשימוש שגרתי לבודד קשורות ביציבות הריבוזום מתחמי הרשת המתהווה (RNCs). שיטה זו מנצלת את הגילוי כי 17 חומצות אמינו ארוכה SecM "מעצר רצף" יכול לעצור את התארכות תרגום פרוקריוטים (<em> א ' coli</em>) המערכת, כאשר מוכנס לתוך (או התמזגו למסוף-C) של חלבון כמעט בכל.
Abstract
מחקר מקיף סיפקה ראיות בשפע טוען כי קיפול חלבונים בתא הוא תהליך שיתוף translational 1-5. עם זאת, המסלול המדויק שרשרת פוליפפטיד כדלקמן במהלך קיפול שיתוף translational להשיג טופס הפונקציונלי הוא עדיין חידה. על מנת להבין את התהליך הזה כדי לקבוע את הקונפורמציה המדויק של שיתוף ביניים של תרגום מתקפלים, חשוב לפתח שיטות המאפשרות בידוד של RNCs שנשאו רשתות המתהווה בגדלים קבועים מראש על מנת לאפשר ניתוח מבנית נוספת שלהם.
SecM (צג הפרשת) הוא 170 חומצות אמינו א ' coli חלבון המווסת את ביטוי של ATPase במורד הזרם (נהיגה הפרשת) SecA ב operon secM-secA 6. Nakatogawa ו איטו במקור נמצא כי רצף 17 חומצות אמינו ארוכה (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) באזור C-terminal של החלבון SecM מספיק וצריךכי השתהות של התארכות SecM ב Gly165, ובכך לייצר peptidyl-glycyl-tRNA קשורה ביציבות אל ריבוזומלי P-האתר 7-9. יתרה מכך, נמצא כי 17 זה רצף חומצות האמינו זמן רב ניתן קיבע את הסופית-C של חלבון כמעט בכל באורך מלא ו / או מקוצר ובכך מאפשר ייצור של RNCs שנשאו רשתות המתהווה בגדלים קבועים מראש 7. לכן, כאשר התמזגו או מוכנס לתוך היעד החלבון, רצף SecM מייצר השתהות מעצרו של התארכות שרשרת פוליפפטיד ומייצר RNCs יציבים הן in vivo של א ' קולי תאים במבחנה במערכת התא ללא. שיפוע צנטריפוגה סוכרוז הוא מנוצל יותר לבודד RNCs.
RNCs את בודדים ניתן לנתח מאפיינים מבניים ותפקודיים של שיתוף ביניים של תרגום מתקפלים. לאחרונה, טכניקה זו שימשה בהצלחה להבנה טובה של המבנה של הריבוזום שרשראות כמה המתהווה קשורות 10,11. כאן אנו מתארים את הבידוד של Crystallin שור Gamma-B RNCs התמזגו כדי SecM ו שנוצר במערכת בתרגום חוץ גופית.
Protocol
Discussion
לקבלת תוצאות לשחזור, איכות ריכוז המרכיבים המשמשים ב שעתוק במבחנה התרגום הן קריטיות. השתמשנו זמינים מסחרית שעתוק במבחנה תמציות תרגום והם נותנים תוצאות יעיל לשחזור, אם מטופל בזהירות. האיכות של ה-mRNA יכול להשפיע על התרגום, ולכן הוא בעל חשיבות עליונה ל?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי תוכנית מדע האדם Frontier מענק RGP0024.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
Riferimenti
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 .
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
