感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製
Summary
インフルエンザウイルスは、宿主細胞のクロマチンに関連して、そのRNAゲノムを複製します。ここでは、感染細胞のクロマチンから無傷のウイルスのリボ核タンパク質複合体を精製する手法を提案する。ウイルスの複合体を精製し、それぞれウェスタンブロット、タンパク質およびRNA含量のプライマー伸長の両方で解析することができます。
Abstract
すべてのマイナス鎖RNAウイルスと同様に、インフルエンザウイルスのゲノムは一本鎖ゲノムは核タンパク質（NP）で包まれ、構成される三量体ポリメラーゼ複合体と関連付けされているウイルスのリボ核タンパク質複合体（vRNPを）の形でパッケージ化されていますPA、PB1、PB2サブユニットとの。しかし、ほとんどのRNAウイルスとは対照的に、インフルエンザウイルスは、感染細胞の核内にウイルスのRNA合成を実行します。興味深いことに、ウイルスmRNAの合成は、プライマーとして、携帯プレmRNAを使用しており、それは、このプロセスは、クロマチン1日に行われることが提案されている。ウイルスポリメラーゼ及び宿主RNAポリメラーゼIIと同様に、NPとホストヌクレオソーム間の相互作用はまた、1,2特徴づけられている。
最近では、One-Strepタグをコードする組換えインフルエンザウイルスの発生は遺伝的であるウイルスポリメラーゼのPB2サブユニットのC末端（rWSN-PB2-球菌3）にした融合enは説明します。これらの組換えウイルスは、感染細胞からのvRNPsなど、PB2を含む複合体の精製を可能にします。精製されたvRNPsを取得するために、培養細胞が感染されており、vRNPsは、親和性、これらの細胞から派生したライセートから精製されています。ただし、日付に使用される溶解の手順は、一般的なヌクレアーゼの存在にもかかわらず、しばしば唯一の非効率的にクロマチンに結合した物質を抽出し、ワンステップの洗剤溶解に基づいてされています。
私たちの予備的な作業は、核vRNPsの大部分は伝統的な細胞溶解中に抽出されなかったことを示唆し、したがって、アフィニティー精製することができませんでした。この抽出効率を高めるために、非クロマチン結合型核vRNPsからクロマチンに結合分離するために、我々は、インフルエンザウイルス感染細胞へ段階的に細胞内抽出プロトコルを適応した。簡単に言うと、このプロシージャは、最初のセルから核を分離し、（ここでは "nucleoplasmic"分数と呼ばれる）水溶性核タンパク質を抽出します。残りの不溶性の核物質は、その後ベンゾナーゼ、二つの塩の抽出手順に続いて非特異的なDNA / RNAヌクレアーゼで消化されます：最初の150mM NaClを（ "ch150"と呼ばれる）を使用し、500mMのNaCl（ "ch500"）（ 図1 。）これらの塩抽出の手順はまだ親和性マトリックスへのタグ付けvRNPsの結合を許可500mMのNaCl、まだ核vRNPsの85％以上を可溶化するのに十分であったという我々の観察に基づいて選ばれました。
感染細胞の細胞内分画後、それは、それぞれ個々の画分からPB2-タグvRNPsの親和性を精製し、それらの蛋白質およびウエスタンブロットおよびプライマー伸長を用いてRNA成分を分析することが可能である。最近、我々は3 500mMのNaCl（ch500）で抽出したクロマチン画分で感染した後に遅れてのポイントの間にそのvRNPをエクスポートする複合体の形を発見するためにこのメソッドを使用しました。
Protocol
Discussion
多くの研究が最近、個々のタンパク質やインフルエンザウイルス感染8に関与する細胞のネットワークを識別しているが、これらの相互作用の大部分の機能的意義は不明である。インフルエンザウイルスRNA合成と核9の複雑な生物物理学的および生化学的性質のためにクロマチンベースの関数の絶対的な依存性を考えると、新技術は、これらの機能を解明する必要があります。 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、rWSN-PB2-球菌ウイルスの灘Naffakhとマリー·アンRameix-Welti（パスツール研究所）に感謝したいと思います。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
Riferimenti
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