De productie van lentivirale vectoren voor transduceren Cellen van het centrale zenuwstelsel
Summary
In dit protocol beschrijven we de productie, zuivering en titratie van lentivirale vectoren. Wij bieden een voorbeeld van lentivirale vector-gemedieerde gen-levering in de eerste gekweekte neuronen en astrocyten. Onze methoden kunnen ook van toepassing op andere celtypen<em> In vitro</em> En<em> In vivo</em>.
Abstract
Efficiënte gen-levering in het centrale zenuwstelsel (CZS) is belangrijk in het bestuderen van gen-functies, het modelleren van neurologische aandoeningen en het ontwikkelen van therapeutische benaderingen. Lentivirale vectoren aantrekkelijk instellingen transductie van neuronen en andere celtypen in CNS omdat zij beide delen en niet-delende cellen ondersteuning aanhoudende expressie van transgenen transduceren en relatief grote verpakkingen capaciteit en lage toxiciteit 1-3. Lentivirale vectoren zijn met succes gebruikt in transduceren veel neurale celtypen in vitro 4-6 en bij dieren 7-10.
Grote inspanningen zijn gedaan om lentivirale vectoren te ontwikkelen met verbeterde bioveiligheid en efficiëntie voor gen delivery. De huidige derde generatie replicatie deficiënt en zelfstandige inactiverende (SIN) lentivirale vectoren in figuur 1. De vereiste elementen voor vector verpakking worden opgesplitst in vier plasmiden. In de lentivirale transfer plasmide, wordt de U3-regio in lang de 5 'terminale herhaling (LTR) vervangen door een sterke promotor van een ander virus. Deze wijziging kan de transcriptie van de vectorsequentie onafhankelijk van HIV-1 Tat eiwit dat normaal nodig is voor HIV genexpressie 11. De verpakking signaal (Ψ) is essentieel voor encapsidering en Rev reagerend element (RRE) nodig om hoge titer vectoren. De centrale polypurine kanaal (cPPT) is voor de nucleaire invoer van de vector DNA, een functie nodig transduceren niet-delende cellen 12. In het 3 'LTR, de cis-regulerende sequenties volledig uit de U3 regio. Deze verwijdering wordt gekopieerd naar 5 'LTR na reverse transcriptie, waardoor transcriptionele inactivatie van beide LTR. Plasmide pMDLg / pRRE bevat HIV-1 gag / pol-genen, die structurele eiwitten en reverse transcriptase te bieden. pRSV-Rev codeert voor Rev, die bindt aan de RRE voor een efficiënte RNA uitvoer uit de kern. pCMV-G codeertde vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSV-G), die HIV-1 Env vervangt. VSV-G vergroot de tropisme van de vectoren en laat de concentratie via ultracentrifugatie 13. Al de genen die coderen voor de accessoire eiwitten, waaronder Vif, Vpr, VPU en Nef zijn uitgesloten in de verpakking systeem. De productie en manipulatie van lentivirale vectoren dienen te worden uitgevoerd volgens de NIH richtlijnen voor onderzoek met recombinant DNA ( http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf ). Een goedkeuring van individuele institutionele biologische en chemische comite voor de veiligheid kan nodig zijn voor het gebruik van lentivirale vectoren. Lentivirale vectoren worden gewoonlijk geproduceerd door cotransfectie van 293T cellen met lentivirale overdracht plasmide en het helper plasmiden die coderen voor de eiwitten vereist vector verpakking. Veel lentivirus overdracht plasmiden en helper plasmiden kunnen worden verkregen uit Addgene een niet-Profit plasmide repository ( http://www.addgene.org/~~V ). Sommige stabiele verpakkende cellijnen zijn ontwikkeld, maar deze systemen minder flexibiliteit en de verpakking efficiëntie algemeen af tijd 14, 15. Commercieel beschikbare transfectie kits kunnen ondersteunen hoge efficiëntie van transfectie 16, maar zij zeer duur zijn voor grootschalige vector preparaten. Calciumfosfaatprecipitatie methoden leveren zeer efficiënte transfectie van 293T-cellen en zorgen zo voor een betrouwbare en kosteneffectieve aanpak voor lentivirale vector productie.
In dit protocol produceren wij lentivirale vectoren door cotransfectie van 293T cellen met plasmiden vier op de calciumfosfaat precipitatie principe, gevolgd door zuivering en concentratie ultracentrifugatie door een 20% sucrose kussen. De vector titers worden bepaald door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) anallyse of door real-time qPCR. De productie en titratie van lentivirale vectoren in dit protocol kan worden afgewerkt met 9 dagen. Wij bieden een voorbeeld van transduceren deze vectoren in muizen neocorticale culturen die zowel neuronen en astrocyten. We tonen aan dat lentivirale vectoren hoge efficiëntie van transductie en celtype-specifieke gen expressie in primaire gekweekte cellen van CNS ondersteunen.
Protocol
Discussion
In dit protocol hebben we laten zien de productie van lentivirale vectoren en de toepassing van deze vectoren in neocorticale culturen. We hebben aangetoond efficiënte en celtype-specifieke transductie met de vectoren die door deze methode. Wanneer de synapsin promoter wordt gebruikt, GFP expressie strikt neuron specifiek. Wanneer de GFAP promoter wordt gebruikt, GFP expressie is uitsluitend in astrocyten. Indien geen celtype-specifieke expressie noodzakelijk is, kan een universele promoter worden gebruikt. We vonden z…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NIH Neuroscience Blueprint Core-subsidie (P30 NS057105, BJS) naar Washington University, Programma Project Grant NS032636 (BJS) en door het Hope Center for Neurological Disorders.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SV3001403 |
| PBS | Mediatech | 21-040-CM |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 |
| HT1080 cells | ATCC | CCL-121 |
| Falcon 100 x 20 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 |
| 1 x 3 ½ in polyallomoer centrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 |
| 0.2-micron syringe filter | Corning | 431219 |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
Riferimenti
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).
- Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons. J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).
- Hioki, H. Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters. Gene Ther. 14, 872-882 (2007).
- Li, M. Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells. J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).
- Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
- Blomer, U. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).
- Consiglio, A. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).
- Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors. J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).
- Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III). Science. 229, 69-73 (1985).
- Sirven, A. The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells. Blood. 96, 4103-4110 (2000).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).
- Farson, D. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).
- Broussau, S. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).
- Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro. J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).
- Mazarakis, N. D. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).
- Kato, S. Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein. Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography. BMC Biotechnol. 9, 10 (2009).
- Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).
- Gasmi, M. Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).
- Palsson, B., Andreadis, S. The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer. Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats. J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).
- Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo. Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).
