Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems
Summary
In diesem Protokoll beschreiben wir Produktion, Reinigung und Titration von lentiviralen Vektoren. Wir bieten ein Beispiel für lentiviralen Vektor-vermittelte Gentransfer in primär kultivierten Neuronen und Astrozyten. Unsere Verfahren können auch auf andere Bauarten gelten<em> In-vitro-</em> Und<em> In-vivo-</em>.
Abstract
Effizienter Gentransfer in das zentrale Nervensystem (ZNS) ist bei der Untersuchung von Genfunktionen wichtig, Modellierung und Entwicklung von neurologischen Erkrankungen therapeutische Ansätze. Lentivirale Vektoren sind attraktive Kandidaten bei der Transduktion von Neuronen und anderen Zelltypen im ZNS, wie sie sowohl sich teilende als auch sich nicht teilende Zellen, Unterstützung anhaltende Expression von Transgenen transduzieren, und relativ große Verpackungen Kapazität und geringer Toxizität 1-3. Lentivirale Vektoren wurden erfolgreich in Transduzieren viele neuronale Zelltypen in vitro 4-6 und 7-10 bei Tieren verwendet.
Große Anstrengungen wurden unternommen, um lentiviralen Vektoren mit verbesserten biologischen Sicherheit und Effizienz für den Gentransfer zu entwickeln. Das aktuelle dritte Generation replikationsdefekt und selbst-inaktivierende (SIN) lentiviralen Vektoren sind in 1 dargestellt. Die erforderlichen Elemente für Vektor-Verpackungen sind in vier Plasmide aufgeteilt. In der lentiviralen transfer Plasmid wird der U3-Region in der 5'-Long Terminal Repeat (LTR) mit einem starken Promotor aus einem anderen Virus ersetzt. Diese Modifikation erlaubt die Transkription der Vektorsequenz unabhängig von HIV-1-Tat-Protein, das normalerweise für HIV-Genexpression 11 erforderlich ist. Das Verpackungssignal (Ψ) ist für die Verpackung und die Rev-reaktive Element (RRE) wesentlich zur Herstellung hoher Titer Vektoren benötigt. Die zentralen Polypurin-Trakt (cPPT) ist für den Kernimport der Vektor-DNA eine Funktion zum Umwandeln nicht teilende Zellen 12 erforderlich wichtig. In der 3 'LTR, werden die cis-regulatorische Sequenzen vollständig von der U3-Region entfernt. Diese Streichung ist auf 5 'LTR nach der reversen Transkription kopiert, was zu einer transkriptionellen Inaktivierung beider LTRs. Plasmide pMDLg / pRRE enthält HIV-1 gag / pol-Gene, die Strukturproteine und Reverse-Transkriptase bereitzustellen. pRSV-Rev Rev codiert, die zur RRE für eine effiziente RNA-Export aus dem Zellkern bindet. pCMV-G codiertdie vesikulären Stomatitis-Virus Glycoprotein (VSV-G), die HIV-1 Env ersetzt. VSV-G erweitert den Tropismus der Vektoren und ermöglicht Konzentration durch Ultrazentrifugation 13. Alle Gene, die für die akzessorischen Proteine, einschließlich vif, vpr, Vpu und Nef sind in der Verpackungs-System ausgeschlossen. Die Herstellung und Manipulation von lentiviralen Vektoren sollte nach den NIH-Richtlinien für die Forschung auf der Basis rekombinanter DNA (durchgeführt werden http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf ). Eine Genehmigung von einzelnen Institutionelle Biologische und Chemische Sicherheit Ausschuss kann vor der Verwendung lentiviralen Vektoren erforderlich sein. Lentivirale Vektoren werden häufig durch Kotransfektion von 293T-Zellen mit lentiviralen Transfer-Plasmid und den Helferplasmide die Proteine kodieren für Vektor-Verpackung erforderlich produziert. Viele lentiviralen Transferplasmide und Helferplasmide kann von Addgene, eine nicht erreicht werdenPlasmid-Profit-Repository ( http://www.addgene.org/~~V ). Einige stabile Verpackungs-Zelllinien entwickelt worden, aber diese Systeme bieten weniger Flexibilität und Effizienz ihrer Verpackung in der Regel lehnt im Laufe der Zeit 14, 15. Im Handel erhältliche Kits können Transfektion unterstützen hohe Effizienz der Transfektion 16, aber sie kann sehr teuer für große Vektorpräparationen. Calciumphosphatpräzipitation Methoden bieten hocheffiziente Transfektion von 293T-Zellen und somit eine zuverlässige und kostengünstige Methode für lentiviralen Vektor Produktion.
In diesem Protokoll, stellen wir lentiviralen Vektoren durch Co-Transfektion von 293T-Zellen mit vier Plasmide auf die Calciumphosphat-Präzipitation grundsätzlich durch Reinigung und Konzentration Ultrazentrifugation durch ein 20% Saccharose-Kissen nachgegangen wurde. Die Vektortiter durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Anallyse oder durch Echtzeit-qPCR. Die Herstellung und Titration von lentiviralen Vektoren in diesem Protokoll kann mit 9 Tagen abgeschlossen sein. Wir bieten ein Beispiel für diese Vektoren Transduktion in murine neokortikalen Kulturen, die sowohl Neuronen und Astrozyten. Wir zeigen, dass lentivirale Vektoren hohen Effizienz der Transduktion und Zelltyp-spezifische Genexpression in primär kultivierte Zellen von CNS unterstützen.
Protocol
Discussion
In diesem Protokoll haben wir die Herstellung von lentiviralen Vektoren und Anwendung dieser Vektoren in neokortikalen Kulturen gezeigt. Wir haben gezeigt, effiziente und Zelltyp-spezifische Transduktion mit den Vektoren durch diese Verfahren hergestellt. Wenn der Synapsin-Promotor verwendet wird, ist die GFP-Expression streng neuronenspezifische. Wenn der GFAP-Promotor verwendet wird, ist die GFP-Expression ausschliesslich in Astrozyten. Wenn kein Zelltyp-spezifische Expression erforderlich ist, kann eine ubiquitäre P…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den NIH Neuroscience Blueprint Core-Zuschuss (P30 NS057105, BJS) nach Washington University, Program Project Grant NS032636 (BJS) und von der Hoffnung, Zentrum für Neurologische Störungen unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SV3001403 |
| PBS | Mediatech | 21-040-CM |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 |
| HT1080 cells | ATCC | CCL-121 |
| Falcon 100 x 20 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 |
| 1 x 3 ½ in polyallomoer centrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 |
| 0.2-micron syringe filter | Corning | 431219 |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
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