In questo protocollo si descrive la produzione, purificazione e titolazione di vettori lentivirali. Forniamo un esempio di vettori lentivirali mediata consegna gene in colture primarie neuroni ed astrociti. I nostri metodi possono valere anche per altri tipi di cellule In vitro E In vivo.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La consegna del gene efficiente nel sistema nervoso centrale (SNC) è importante per studiare le funzioni dei geni, modellando le malattie neurologiche e lo sviluppo di approcci terapeutici. Vettori lentivirali sono strumenti interessanti nella trasduzione di neuroni e altri tipi di cellule nel sistema nervoso centrale come trasducono entrambe le cellule che si dividono e non dividere, espressione sostegno costante dei transgeni, e hanno capacità di confezionamento relativamente grande e bassa tossicità 1-3. Vettori lentivirali sono stati utilizzati con successo nella trasduzione molti tipi di cellule neurali in vitro e negli animali 4-6 7-10.
Notevoli sforzi sono stati fatti per sviluppare vettori lentivirali con una migliore biosicurezza ed efficienza per la consegna gene. Le correnti di terza generazione replicazione-difettosi e auto-inattivazione (SIN) vettori lentivirali sono rappresentati nella Figura 1. Gli elementi necessari per il confezionamento vector sono divisi in quattro plasmidi. Nel lentivirale transFer plasmide, la regione U3 lunga ripetizione terminale in 5 '(LTR) viene sostituito con un promotore forte da un altro virus. Questa modifica permette la trascrizione della sequenza vettore indipendente di HIV-1 Tat proteina che è normalmente richiesto per l'espressione genica HIV 11. Il segnale di imballaggio (Ψ) è essenziale per incapsidamento e l'elemento reagente Rev (RRE) è richiesto per produrre vettori alto titolo. Il tratto centrale polypurine (cPPT) è importante per l'importazione nucleare del DNA vettore, una caratteristica necessaria per trasduzione non-cellule che si dividono 12. Nella 3 'LTR, le sequenze cis-regolatori vengono completamente rimosso dalla regione U3. Questa soppressione è copiato 5 'LTR dopo la trascrizione inversa, con conseguente inattivazione trascrizionale di entrambi LTR. PMDLg plasmide / pRRE contiene HIV-1 gag / pol geni, che forniscono proteine strutturali e trascrittasi inversa. PRSV-Rev codifica Rev che si lega al RRE efficiente per l'esportazione di RNA dal nucleo. pCMV-G codificala glicoproteina virus della stomatite vescicolare (VSV-G) che sostituisce HIV-1 Env. VSV-G espande il tropismo dei vettori e permette di concentrarsi tramite ultracentrifugazione 13. Tutti i geni che codificano le proteine accessorie, tra Vif, Vpr, Vpu, e Nef sono esclusi nel sistema di imballaggio. La produzione e manipolazione dei vettori lentivirali deve essere effettuata secondo le linee guida per la ricerca NIH implicano il DNA ricombinante ( http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf ). L'omologazione da individuo comitato istituzionale per la sicurezza biologica e chimica può essere richiesto prima di utilizzare vettori lentivirali. Vettori lentivirali sono comunemente prodotte da cellule 293T cotrasfezione con trasferimento lentivirale plasmide ed i plasmidi helper che codificano le proteine necessarie per il confezionamento vettore. Molti plasmidi trasferimento lentivirali e plasmidi helper possono essere ottenute da Addgene, non-Profit repository plasmide ( http://www.addgene.org/~~V ). Alcuni stabili linee cellulari di confezionamento sono state sviluppate, ma questi sistemi offrono minore flessibilità e l'efficienza imballaggio diminuisce generalmente nel tempo 14, 15. Kit di transfezione disponibili in commercio possono supportare elevata efficienza di trasfezione 16, ma possono essere molto costoso per preparazioni di grandi dimensioni vettore. Metodi di precipitazione di fosfato di calcio fornire trasfezione molto efficiente di cellule 293T e fornire così un approccio affidabile e conveniente per la produzione di vettori lentivirali.
In questo protocollo, si produrre vettori lentivirali per cotrasfezione di cellule 293T con quattro plasmidi basati sul principio di precipitazione con fosfato di calcio, seguito da purificazione e concentrazione con ultracentrifugazione attraverso un cuscino di saccarosio 20%. I titoli vettore sono determinate da fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) analelisi o qPCR in tempo reale. La produzione e la titolazione dei vettori lentivirali di questo protocollo può essere rifinito con 9 giorni. Forniamo un esempio di trasduzione questi vettori in murini culture neocorticali contenenti sia i neuroni e astrociti. Dimostriamo che i vettori lentivirali sostenere ad alta efficienza di trasduzione e delle cellule tipo-specifica espressione genica nelle cellule primarie in coltura da CNS.
Protocollo
1. Packaging di vettori lentivirali
Vettori lentivirali sono prodotte da cotrasfezione di un vettore di trasferimento lentivirale ed altri plasmidi necessari per il confezionamento in cellule 293T secondo il metodo trasfezione fosfato di calcio. Usiamo 10 da 100 mm, piatti di coltura di tessuto di questo protocollo. Esso può essere aumentato o basso a seconda delle applicazioni. La linea cellulare 293T viene mantenuta in modificato da Dulbecco (DMEM) con glucosio (4500 mg / L), integrato con 10% siero fetale bovino (FBS), 100 unità / ml di penicillina, 100 pg / ml di streptomicina a 37 ° C incubatore con il 5% di CO 2.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In questo protocollo, abbiamo dimostrato la produzione di vettori lentivirali e l'applicazione di questi vettori nelle culture neocorticali. Abbiamo dimostrato efficace e cellula-specifico tipo trasduzione con i vettori prodotti da questi metodi. Quando il promotore sinapsina viene utilizzata, l'espressione della GFP è strettamente neurone specifico. Quando il promotore GFAP viene utilizzata, l'espressione della GFP è esclusivamente in astrociti. Se nessun tipo-specifico espressione cellulare è richiesto, un.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal NIH Neuroscience Blueprint Nucleo di assegnazione (P30 NS057105, BJS) per Washington University, programma di progetto di Grant NS032636 (BJS) e dal Centro Hope for Neurological Disorders.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Siero fetale bovino | Hyclone | SV3001403 | |
| PBS | Mediatech | 21-040-CM | |
| Tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| Butirrato di sodio | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Hexadimethrine bromuro (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Cellule 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HT1080 cellule | ATCC | CCL-121 | |
| Falcon 100 x 20 mm del tessuto culture piatto | BD Biosciences | 353003 | |
| 1 x 3 ½ in provetta polyallomoer | Beckman-Coulter | 326823 | |
| 0,2-micron filtro a siringa | Corning | 431219 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
Riferimenti
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
