Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi
Summary
Bu protokolü biz üretim, saflaştırma ve lentiviral vektörlerin titrasyonu açıklar. Biz primer kültürlerinde nöronlar ve astrositlerde lentiviral vektör aracılıklı gen aktarımının bir örnek oluşturmaktadır. Bizim yöntemleri diğer hücre türleri için de geçerli olabilir<em> In vitro</em> Ve<em> In vivo</em>.
Abstract
Merkezi sinir sistemi (MSS) etkili gen teslim nörolojik hastalıklar modelleme ve tedavi yaklaşımların geliştirilmesinde, gen fonksiyonları okuyor önemlidir. Lentiviral vektörler ikisi de bölünmesi ve non-bölünen hücreleri, transgenlerin destek sürekli ifade transdüksiyonu olarak MSS nöronlar ve diğer hücre tipleri iletiminde çekici araçlar ve nispeten büyük paketleme kapasitesi ve düşük toksisite 1-3 var. Lentiviral vektörler başarılı bir in vitro 4-6 birçok sinir hücre tipleri transdüklenmesinden ve 7-10 hayvanlarda kullanılmıştır.
Büyük çabalar geliştirilmiş biyogüvenlik ve gen teslimatı için verimlilik ile lentiviral vektörler geliştirmek için yapılmıştır. Mevcut üçüncü nesil çoğaltma-arızalı ve kendini inaktive (SIN) lentiviral vektörler Şekil 1'de gösterilmiştir. Vektör paketleme için gerekli elemanları dört plazmidler ayrılır. Lentiviral transplazmid fer, 5 ', uzun terminali tekrarlama (LTR) içinde U3 bölge başka bir virüs kuvvetli bir promotör ile değiştirilir. Bu normal olarak modifikasyonu HIV gen ifadesi 11 için gerekli olan HIV-1 Tat protein vektörü sekansının transkripsiyon bağımsız sağlar. Ambalaj sinyali (Ψ) encapsidation ve Rev-duyarlı elementi (HKD) için gerekli olan yüksek titresi vektörler üretimi için gereklidir. Merkez polypurine yolu (cPPT) vektörü DNA Nükleer alma, non-bölünen hücre 12 transdüklenmesinden için gerekli bir özellik için önemlidir. 3 'LTR olarak, cis-düzenleyici sekanslar tamamen U3 bölgesi kaldırılır. Bu silme işlemi iki LTR transkripsiyonel inaktivasyonu sonucunda, ters transkripsiyon sonra 5 'LTR kopyalanır. Plazmid pMDLg / pRRE yapısal proteinler ve ters transkriptaz temin HIV-1 GAG / pol genler, içerir. pRSV-Rev çekirdekten verimli RNA ihracat için HKD bağlar Rev kodlar. pCMV-G kodlarHIV-1 Env yerini veziküler stomatit virüsü glikoprotein (VSV-G). VSV-G vektörlerin tropizmi genişler ve ultra-santrifüj ile 13 konsantrasyonu sağlar. Vif, VPR, VPU ve Nef gibi aksesuar proteinleri şifreleyen genler Bütün, ambalaj sistemi içinde tutulur. Lentiviral vektörlerin üretim ve manipülasyon rekombinant DNA (ilgili araştırma için NIH kurallarına göre yapılmalıdır http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf ). Bireysel Kurumsal Biyolojik ve Kimyasal Güvenlik Komitesinden bir onay lentiviral vektörler kullanmadan önce gerekli olabilir. Lentiviral vektörleri genellikle lentiviral transferi plazmid vektörü ve ambalaj için gerekli olan proteinleri şifreleyen plazmitler ile birlikte yardımcı 293T hücrelerinin kotransfeksiyonu ile üretilmektedir. Birçok lentiviral transferi ve plazmid helper plazmidler Addgene, bir non elde edilebilirKar plazmid deposu ( http://www.addgene.org/~~V ). Bazı stabil ambalaj hücre hatları geliştirilen, ancak zamanla bu sistemler üzerinden 14 daha az esneklik ve paketleme verimliliği genellikle azalır, 15 sunmak olmuştur. Piyasada bulunan transfeksiyon kitleri transfeksiyon 16 yüksek verimlilik desteği olabilir, ancak büyük ölçekli vektör hazırlıkları için çok pahalı olabilir. Kalsiyum fosfat çöktürme yöntemleri 293T hücrelerinin yüksek verimli transfeksiyon sağlamak ve böylece lentiviral vektör üretimi için güvenilir ve maliyet etkin bir yaklaşım sağlamak.
Bu protokolde, bir% 20 sukroz yastık yoluyla saflaştırma ve ultra-santrifüj ile konsantrasyon izledi kalsiyum fosfat çöktürme prensibine dayanan dört plazmit ile 293T hücrelerinin kotransfeksiyonu ile lentiviral vektörler üretirler. Vektör titreleri floresans aktive hücre sıralama (FACS) anal tarafından belirleniranalizden veya gerçek zamanlı qPCR tarafından. Bu protokolde lentiviral vektörlerin üretimi ve titrasyon 9 gün ile bitmiş olabilir. Biz nöron ve astrositlerine içeren fare neokortikal kültürleri içine bu vektörlerin transducing bir örnek sağlar. Biz lentiviral vektörler iletimi ve MSS primer kültürlerinde hücrelerinde hücre tipine özgü gen ekspresyonu yüksek verimlilik desteği göstermektedir.
Protocol
Discussion
Bu protokolde, bu neokortikal kültürlerde bu vektörlerin lentiviral vektörler ve uygulamanın üretimi göstermiştir. Bu yöntem tarafından üretilen vektörleri ile verimli ve hücre tipinde belirli bir transdüksiyon-göstermiştir. Synapsin promotör kullanıldığında, GFP tanımı katı nöron özgüdür. GFAP organizatörü kullanıldığında, GFP astrositlerde münhasıran. Herhangi bir hücre tipinde belirli-ifadesi gerekli ise, her yerde bulunan bir promotör kullanılabilir. Biz sahipleri neokortikal k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Washington Üniversitesi, Programı Projesi Hibe NS032636 (BJS) ile NIH Neuroscience Blueprint Çekirdek hibe (P30 NS057105, BJS) tarafından ve Sinir Hastalıkları Umut Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SV3001403 |
| PBS | Mediatech | 21-040-CM |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 |
| HT1080 cells | ATCC | CCL-121 |
| Falcon 100 x 20 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 |
| 1 x 3 ½ in polyallomoer centrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 |
| 0.2-micron syringe filter | Corning | 431219 |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
Riferimenti
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).
- Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons. J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).
- Hioki, H. Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters. Gene Ther. 14, 872-882 (2007).
- Li, M. Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells. J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).
- Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
- Blomer, U. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).
- Consiglio, A. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).
- Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors. J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).
- Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III). Science. 229, 69-73 (1985).
- Sirven, A. The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells. Blood. 96, 4103-4110 (2000).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).
- Farson, D. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).
- Broussau, S. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).
- Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro. J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).
- Mazarakis, N. D. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).
- Kato, S. Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein. Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography. BMC Biotechnol. 9, 10 (2009).
- Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).
- Gasmi, M. Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).
- Palsson, B., Andreadis, S. The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer. Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats. J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).
- Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo. Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).
