分离人脐静脉内皮细胞和水流条件下其使用中的中性粒细胞轮回研究
Summary
本文首先介绍了人类脐静脉内皮细胞的分离的过程，然后演示如何使用这些细胞检查流量条件下的中性粒细胞轮回。通过使用低体积流量室从玻璃的光学特性的聚合物制成，活细胞荧光成像罕见的细胞群也是可能的。
Abstract
中性粒细胞白血细胞中最丰富的类型。它们形成了一个1的先天免疫系统的重要组成部分。在急性炎症，中性粒细胞的炎性细胞迁移到损伤部位。损伤部位的中性粒细胞的招聘是一个循序渐进的过程，包括第一，扩张血管，增加血流量;第二，微血管结构变化和血浆蛋白从血液中逸出;第三，滚动，粘附和对面的中性粒细胞的轮回内皮细胞;和第四积累的中性粒细胞在损伤2,3网站。宽阵列在体内和体外方法已发展到使这些过程的研究，4。这种方法侧重于在人类内皮细胞中性粒细胞轮回。
检查中性粒细胞的轮回中所涉及的分子过程的一个流行的方法是利用人Neutrophils相互作用与原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）5。中性粒细胞分离已直观地描述在别处6，因此本文将显示HUVEC的隔离方法。一旦分离，成长为汇合，内皮细胞被激活，产生粘附和活化分子的上调。例如，激活内皮细胞与细胞因子如TNF-α的结果增加了E-选择素和IL-8表达7。 E-选择素介导中性粒细胞和IL-8介导的激活和坚定的中性粒细胞粘附的捕获和滚动。后粘附中性粒细胞的轮回。轮回可以paracellularly发生，通过内皮细胞路口或transcellularly通过内皮细胞本身。在大多数情况下，这些相互作用的发现在血管7,8流条件下发生的。
平行板流动腔是一种广泛使用的系统，MI液力剪切应力话筒，发现在体内和体外 9,10水流条件下使中性粒细胞招聘研究。有几家公司生产平行平板流室和每个人都有优点和缺点。如果荧光成像是必要的，需要使用玻璃或光学类似的聚合物。内皮细胞不生长在玻璃上。
在这里，我们提出了一个简便，快速的中性粒细胞轮回相衬，DIC和荧光成像的方法，用低量ibidi通道幻灯片，支持快速的人血管内皮细胞的粘附和生长，并具有光学质量相媲美的聚合物制成的玻璃。在此方法中，内皮细胞生长和刺激在ibidiμslide。中性粒细胞被引入流量条件下，轮回进行了评估。路口旁程度与决心使实时荧光成像跨细胞轮回。
Protocol
Discussion
研究人员经常使用不同血管床的血管内皮细胞研究中性粒细胞的招聘和轮回。例子包括，但不仅限于，真皮微血管内皮细胞，肝窦内皮细胞13和10人脐静脉内皮细胞。其中，人脐静脉内皮细胞获得了广受欢迎，因为它们相对容易隔离和可用性。 HUVEC的是一个强大的体外模型系统，可以模仿许多发生在体内的内皮进程。这个模型系统已帮助识别粘附分子和趋化因子?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢的翩Colarusso博士和协助成像和图像分析活细胞成像设备;女士为她的技术援助Lailey和单位在提供人类脐带在卡尔加里，AB山麓医院51。川崎病帕特尔博士是艾伯塔创新：健康解决方案的科学家。这项工作是从加拿大健康研究，并从加拿大创新和阿尔伯塔省科学和研究的权威机构的基础设备和基础设施补助机构的经营拨款支持。
Materials
| Reagent and Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
Riferimenti
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
- Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
- Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
- Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it’s all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
- Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
- Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys – Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
- Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
- Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
