Questo articolo descrive prima di una procedura per isolare cellule endoteliali umane da vena ombelicale e poi mostra come utilizzare queste cellule per esaminare la trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso. Utilizzando un basso volume camera di flusso realizzati da un polimero con le caratteristiche ottiche di vetro, live-cellula imaging a fluorescenza di popolazioni di cellule rare è anche possibile.
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Articolo metodologico
Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso
In questo articolo
Sommario
Abstract
I neutrofili sono il tipo più abbondante di globuli bianchi. Essi costituiscono una parte essenziale del sistema immune innato 1. Durante l'infiammazione acuta, i neutrofili sono le prime cellule infiammatorie a migrare verso il luogo della ferita. Assunzione di neutrofili a un sito della lesione è un processo graduale che comprende in primo luogo, la dilatazione dei vasi sanguigni per aumentare il flusso di sangue, in secondo luogo, microvascolari cambiamenti strutturali e la fuga di proteine del plasma dal sangue, in terzo luogo, rolling, adesione e la trasmigrazione dei neutrofili attraverso l' accumulo di neutrofili e quarto al sito della lesione 2,3; endotelio. Una vasta gamma di in vivo e in vitro è evoluto per consentire lo studio di questi processi 4. Questo metodo si concentra sulla trasmigrazione neutrofili attraverso cellule endoteliali umane.
Un metodo popolare per esaminare i processi molecolari coinvolti nella trasmigrazione dei neutrofili utilizza umana neutrophils interagiscono con le cellule primarie umane vena ombelicale endoteliali (HUVEC) 5. L'isolamento dei neutrofili è stato descritto visivamente altrove 6; così questo articolo mostrerà il metodo per l'isolamento di HUVEC. Una volta isolate e coltivate a confluenza, le cellule endoteliali vengono attivate causando la sovraregolazione di molecole di adesione e di attivazione. Ad esempio, l'attivazione di cellule endoteliali con citochine come TNF-a risultati aumentati E-selectina e IL-8 espressione 7. E-selectina media di cattura e di rotolamento dei neutrofili e IL-8 di attivazione media e ferma adesione dei neutrofili. Dopo l'adesione dei neutrofili trasmigrare. Trasmigrazione può avvenire paracellularly (mediante giunzioni di cellule endoteliali) o transcellularly (attraverso la cellula endoteliale stesso). Nella maggior parte dei casi, queste interazioni avvengono in condizioni di flusso presenti nel sistema vascolare 7,8.
Il parallelo camera di flusso piatto è un sistema largamente utilizzato, che mimicrofoni il taglio idrodinamico sollecitazioni trovato in vivo e permette lo studio del reclutamento dei neutrofili in condizioni di flusso in vitro 9,10. Diverse aziende producono parallele camere di flusso di targa e hanno ciascuno vantaggi e svantaggi. Se fluorescente immagini è necessario, vetro o un polimero otticamente simile deve essere utilizzato. Le cellule endoteliali non crescono bene su vetro.
Presentiamo qui un metodo semplice e rapido per l'imaging a contrasto di fase, DIC e fluorescente di trasmigrazione neutrofili con un basso volume di diapositiva canale ibidi fatto di un polimero che supporta l'adesione e rapida crescita di cellule endoteliali e ha qualità ottiche comparabili a vetro. In questo metodo, le cellule endoteliali sono state coltivate e stimolata in μslide ibidi. I neutrofili sono stati introdotti in condizioni di flusso e la trasmigrazione è stata valutata. Imaging a fluorescenza delle giunzioni attivato in tempo reale la determinazione del grado di paracellulare rispettotrasmigrazione transcellulare.
Protocollo
1. Isolamento e manutenzione di cellule endoteliali vascolari umane
- Procedure di biosicurezza di livello 2 deve essere utilizzato quando si lavora con sangue umano e dei tessuti. Utilizzando forbici tagliare il cordone dalla placenta e poi esaminate con attenzione il cavo di coaguli di sangue ei danni causati dalla chiusura il cavo durante il parto. Tagliare ed eliminare queste porzioni del midollo.
- Preparare la soluzione fresca collagenasi a 1 mg / ml versando 50 ml di tampone cavo caldo in un tubo che contiene 50 mg di collagenasi.
- Cambia in guanti sterili e aprire un vassoio contenente sterilizzati sterilizzato strumento cannule smus....
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Discussione
I ricercatori hanno utilizzato di routine cellule endoteliali da diversi letti vascolari per studiare il reclutamento dei neutrofili e trasmigrazione. Esempi includono, ma non sono limitati a, derma cellule endoteliali microvascolari 12, fegato cellule endoteliali sinusoidali 13 e cellule endoteliali di vena ombelicale umano 10. Tra questi HUVEC acquisito vasta popolarità a causa della loro relativa facilità di isolamento e di disponibilità. HUVEC sono un potente modello in vit.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. Pina Colarusso e Live strumento imaging cellulare per la loro assistenza, con immagini e analisi di immagine, la signora Lailey per la sua assistenza tecnica, e 51 unità presso l'Ospedale Foothills in Calgary, AB per la fornitura di cordoni ombelicali umani. Dr. KD Patel è un Innovates Alberta: Salute Scientist Solutions. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di funzionamento degli Istituti canadesi di ricerca Salute e contributi per investimenti fissi e delle infrastrutture da parte della Fondazione canadese per l'innovazione e la scienza Alberta e Autorità di ricerca.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente e | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Collagenasi di tipo 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord tampone | Composizione: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucosio in 1mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 tampone a pH 7,4 | ||
| Media cellule endoteliali (ECM) | M199 con sali aquila integrati con il 16% di siero umano contenente 100 unità di penicillina 100 mg di streptomicina e 0,3 mg di L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillina glutammato streptomicina (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi camere | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Soluzione di albumina umana 20% | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS senza Ca 2 + e Mg 2 + | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS con Ca 2 + e Mg 2 + | Sigma | H1387-10X |
Riferimenti
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-....
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Ristampe e permessi
