Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l'étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d'écoulement
Summary
Cet article décrit tout d'abord une procédure pour isoler les cellules endothéliales humaines de veines ombilicales puis montre comment utiliser ces cellules pour examiner la transmigration des neutrophiles dans des conditions d'écoulement. En utilisant une chambre d'écoulement à faible volume faite d'un polymère avec des caractéristiques optiques de verre, des cellules vivantes d'imagerie de fluorescence de populations de cellules rares est également possible.
Abstract
Les neutrophiles sont le type le plus abondant de globules blancs. Ils constituent une partie essentielle du système immunitaire inné 1. Au cours de l'inflammation aiguë, les neutrophiles sont des cellules inflammatoires premiers à migrer vers le site de la lésion. Le recrutement des neutrophiles à un site de la lésion est un processus par étapes qui comprend d'abord, la dilatation des vaisseaux sanguins pour augmenter le flux sanguin, en deuxième lieu, les changements structurels microvasculaires et d'échapper à des protéines plasmatiques de la circulation sanguine, en troisième lieu, le laminage, l'adhérence et la transmigration des neutrophiles dans l'ensemble du accumulation et quatrième neutrophiles au site de la lésion 2,3; endothélium. Un large éventail de in vivo et di vitro a évolué pour permettre l'étude de ces 4 processus. Cette méthode met l'accent sur la transmigration des neutrophiles à travers les cellules endothéliales humaines.
Une méthode populaire pour l'examen des processus moléculaires impliqués dans la transmigration des neutrophiles utilise humaine neutrophils interagissant avec les cellules humaines primaires endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) 5. L'isolement des neutrophiles a été décrit visuellement ailleurs 6; donc cet article vous montrera la méthode pour l'isolement de cellules HUVEC. Une fois isolées et cultivées à confluence, les cellules endothéliales sont activées aboutissant à la régulation à la hausse des molécules d'adhésion et l'activation. Par exemple, l'activation des cellules endothéliales avec des cytokines telles que le TNF-alpha entraîne la E-sélectine augmenté et IL-8 expression 7. E-sélectine médie de capture et le laminage de neutrophiles et d'IL-8 et d'activation de médiateur d'adhérence ferme de neutrophiles. Après neutrophiles adhérence transmigrer. Transmigration peut se produire paracellularly (à travers les jonctions des cellules endothéliales) ou transcellularly (à travers la cellule endothéliale elle-même). Dans la plupart des cas, ces interactions se produisent dans des conditions d'écoulement trouvés dans le système vasculaire 7,8.
La chambre de plaques parallèles de débit est un système largement utilisé que mile cisaillement hydrodynamique micros contraintes trouvé in vivo et permet l'étude du recrutement des neutrophiles dans des conditions d'écoulement in vitro 9,10. Plusieurs entreprises produisent parallèles chambres d'écoulement de la plaque et ont chacune leurs avantages et leurs inconvénients. Si fluorescente imagerie est nécessaire, en verre ou en une optiquement similaire polymère doit être utilisé. Les cellules endothéliales ne poussent pas bien sur le verre.
Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour l'imagerie à contraste de phase, DIC et de la transmigration des neutrophiles fluorescente utilisant une lame de faible volume canal ibidi constitué d'un polymère qui prend en charge l'adhérence et la croissance rapides des cellules endothéliales humaines et a des qualités optiques qui sont comparables à verre. Dans cette méthode, les cellules endothéliales ont été cultivées et stimulées dans une μslide ibidi. Les neutrophiles ont été introduits dans des conditions d'écoulement et de la transmigration a été évaluée. L'imagerie de fluorescence des jonctions activé en temps réel de détermination de l'étendue de paracellulaire par rapporttransmigration transcellulaire.
Protocol
Discussion
Les chercheurs ont systématiquement utilisé des cellules endothéliales à partir de différents lits vasculaires pour étudier le recrutement des neutrophiles et la transmigration. Les exemples incluent, mais ne sont pas limités à, des cellules endothéliales microvasculaires dermiques 12, le foie les cellules endothéliales sinusoïdales 13 et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine 10. Parmi eux HUVEC acquis une grande popularité en raison de leur relative f…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Pina Colarusso et le Fonds pour Live Cell Imaging pour leur aide avec l'imagerie et l'analyse d'image, Mme Lailey pour son assistance technique et l'unité 51 à l'Hôpital Foothills de Calgary, AB pour la fourniture de cordons ombilicaux humains. Le Dr Patel KD est un Innovates Alberta: Health Solutions scientifique. Ce travail a été soutenu par une subvention de fonctionnement de l'Institut canadien de recherche en santé et subventions d'équipement et d'infrastructure de la Fondation canadienne pour l'innovation et l'Alberta Science and Research Authority.
Materials
| Reagent and Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
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