Vi tilvejebringe en enkel, semikvantitativ metode til at undersøge biofilmdannelse<em> In vitro</em>. Denne fremgangsmåde drager fordel af den Zeiss STEMI 2000-C dissektionsmikroskop (med kameraet fastgørelse) for at overvåge både timing og mønstret af biofilmdannelse, som vurderet ved udviklingen af rynkede kolonier.
Biofilm, eller overfladeaktive vedhæftede samfund af celler indkapslet i en ekstracellulær matrix, udgør en fælles livsstil for mange bakterier. Inden for en biofilm, ofte bakterieceller udviser ændret fysiologi, herunder et øget resistens over for antibiotika og andre miljømæssige belastninger 1. Desuden kan biofilm spille vigtige roller i host-mikrobe interaktioner. Biofilm udvikler, når bakterier overgangen fra enkelte, planktoniske celler danne komplekse, multi-cellulære samfund 2. I laboratoriet er biofilm studeres ved at vurdere udviklingen af specifikke biofilm fænotyper. En almindelig biofilm fænotype involverer dannelsen af krøllede eller rugose bakteriekolonier på fast agar medier 3. Rynket kolonidannelse tilvejebringer en særlig enkel og nyttig måde til at identificere og karakterisere bakteriestammer udviser ændret biofilm fænotyper, og at undersøge miljømæssige betingelser, som påvirker biofilmdannelse. WRInkled kolonidannelse tjener som en indikator for biofilmdannelse i en række bakterier, herunder både Gram-positive bakterier, såsom Bacillus subtilis 4 og Gram-negative bakterier, såsom Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, og Vibrio fischeri 8.
Den marine bakterie V. fischeri er blevet en model for biofilmdannelse på grund af den kritiske rolle af biofilm under host kolonisering: biofilm produceret af V. fischeri fremme sin kolonisering af de hawaiiansk stumphale blæksprutte Euprymna scolopes 8-10. Vigtigt, biofilm fænotyper observeret in vitro korrelerer med evne V. fischeri celler effektivt kolonisere værtsdyr: stammerne svækkede til biofilmdannelse in vitro har en kolonisering defekt 9,11, mens stammer udviser forøgetbiofilm fænotyper forstærkes for kolonisering 8,12. V. fischeri giver derfor en simpel model system til at vurdere de mekanismer, som bakterierne regulerer biofilmdannelse og hvordan biofilm indvirkning vært kolonisering.
I denne rapport beskriver vi en semi-kvantitativ metode til at vurdere biofilmdannelse hjælp V. fischeri som et modelsystem. Denne fremgangsmåde involverer omhyggelig pletning af bakterielle kulturer ved definerede koncentrationer og mængder på faste agarmedier, en plettet kultur er synonymt med en enkelt bakteriekoloni. Denne "spotted kultur 'teknik kan anvendes til at sammenligne brutto biofilm fænotyper på enkelte, nærmere angivne tidspunkter (end-point assays), eller til at identificere og karakterisere subtile biofilm fænotyper gennem tiden-retters analyser af biofilm udvikling og målinger af kolonien diameter , som er påvirket af biofilm-dannelse. Denne teknik tilvejebringer en semi-kvantitativ analyse af biofilmdannelse prenhed overfører evaluering af timingen og mønster af rynket koloni udvikling og den relative størrelse af at udvikle struktur, egenskaber, der rækker ud over den simple overordnede morfologi.
I dette arbejde beskriver vi en semikvantitativ metode til vurdering af biofilmdannelse hjælp V. fischeri som en model organisme. Specifikt anvender vi et dissektionsmikroskop med kameraet fastgørelse til overvågning biofilmdannelse og udvikling rynket kolonidannelse over tid på en fast agaroverfladen. I denne protokol, skitsere vi to specifikke typer af metoder vi normalt bruger til at vurdere rynket koloni-dannelse. Den første er det end-point analyse, som giver os mulighed for at observere den endelige, samlede 3D arkitektur, mønster, og diameteren af en plettet kultur på en udvalgt "endelig" tidspunkt. Denne fremgangsmåde er mest anvendelig til vurdering af mutantstammer eller tilstande, der fører til dramatisk defekter i biofilmdannelse. Men denne fremgangsmåde ikke skelne mellem mere subtile forskelle, som opstår på tidspunkter før det valgte slutpunkt. Bedre kunne overvåge rynket kolonidannelse, bruger vi et tidsforløb analyse, som giver os mulighed for at identificere starten af wrinkled kolonidannelse og se dens udvikling over tid. Som et resultat af denne fremgangsmåde, kan mere subtile forskelle i timingen af rynket kolonidannelse, 3D arkitektur, og mønsterdannelse identificeres. Vi anvendte det tidsforløb assay til at generere to semi-kvantitative analyser af biofilmdannelse. For det første kan det tidspunkt, hvor en stamme begynder at udvikle 3D arkitektur sammenlignes med den for kontrolstammer. Vi har fundet, at forsinkelsen i biofilmen dannelse af en bestemt mutant under de samme betingelser er relativt konsistent 9. F.eks. I de data der er vist i fig 2, mutant konsekvent udviste omkring en 4 h forsinkelse initiering biofilmdannelse. En anden semi-kvantitativ måling af biofilmdannelse er ændringen i størrelse af diameteren af den rynkede koloni (plet). Vi har fundet, at diameteren af rynkede kolonier gradvis adskiller sig fra ikke-biofilm kolonier, når omkring en 2-fold forskel i slutningen tidspunkt (fig. 3 </strong>) (Morris og Visick, upublicerede data). Til dato har vi ikke observeret en fænotype uden den anden (dvs. biofilmdannelse uden en stigning i koloni diameter) (upublicerede data), selv om det stadig er muligt nogle mutanter vil opføre sig anderledes. Faktisk er det blevet rapporteret for V. cholerae, at nogle rynkede kolonier resulterer i en betydelig stigning i koloni diameter, mens andre ikke gør 15. Alligevel kunne vurdere ændringen i diameter over tid hjælpe med karakterisering af potentielle biofilm mutanter og / eller give en ekstra kvantitativ måling af mutanter med forsinkelser i udviklingen. De to mål for biofilmdannelse (tid og diameter), er at bestemme begyndelsen af rynkede kolonidannelse mere følsomme, men også mere subjektiv end bestemmelse af diameteren af stedet. Alligevel begge foranstaltninger giver en semi-kvantitativ vurdering af en fænotype, der er yderst nyttigt at biofilm forskere, men ikke let kan quantification.
Ved udførelse af plettede dyrkede analyser, er det vigtigt at overveje de miljømæssige forhold, som de plettede stammer dyrkes. Rynket kolonidannelsen er ofte påvirket af forskellige miljømæssige forhold, herunder næringsstof tilgængelighed, temperatur og fugtighed. At reducere variabilitet mellem eksperimenter, er det nyttigt at standardisere disse betingelser meget muligt (dvs. standardisering af agarplader til et sæt volumen og dyrkning af plettede stammer ved en kontrolleret temperatur). For yderligere kontrol for variabilitet mellem spotte eksperimenter, er vigtigt at medtage de relevante kontrol-stammer inden for hvert sæt af eksperimenter. Endelig, ved fortolkning af data fra disse analyser, er det nødvendigt at udføre et eksperiment flere gange (3 +), især ved vurderingen af subtile forskelle i rynket kolonidannelse (fx en forsinkelse i biofilmdannelse eller mønster forskelle). Nogle begrænsninger af denne protokol er: 1) determinning om cellerne har en defekt i vækst kan være vanskeligt: vækst af cellerne i flydende kultur kan ikke nøjagtigt afspejle vækstrater på faste medier, og en nøjagtig bestemmelse af væksten af biofilm-dannende celler, som kan klæbe sammen, muligvis ikke; 2) stammer med vækstdefekter vil være problematisk at analysere, 3) er det måske ikke muligt at skelne diameter forskelle mellem stammer med små biofilm fænotyper, 4) for stammer, som ikke vokser i en koncentrisk ring er det måske ikke muligt præcist at måle ændringer i diameter, 5), medens mønsterdannelse kan observeres under biofilmdannelse, er der ingen måde til at kvantificere mønsterdannelse af den resulterende biofilmen og 6) der er ingen måde at måle Z-dimensionen af biofilmen med denne forsøgsopstilling . På trods af disse begrænsninger, men ikke desto mindre protokol giver et middel til at opnå numeriske data til at hjælpe med at vurdere krøllede koloni-dannelse.
I denne protokol, anvender vi en bestemt billedbehandlingsystem (dvs. en Zeiss dissektionsmikroskop og Progres CapturePro imaging software) at observere og vurdere rynket koloni-dannelse. Det billeddannende system, der er beskrevet her, er effektive: evnen til at detektere starten af rynkede kolonidannelse, og derved vurdere udviklingen med et tidsforløb fremgangsmåde, forøges kraftigt ved anvendelse af et dissektionsmikroskop. Men hvis denne teknologi ikke er tilgængelig, kan protokollen tilpasses til anvendelse med andet udstyr, herunder et enkelt digitalkamera med en zoom fokus. Medens denne protokol fokuserer på vurdering af rynket koloni udvikling kan det også modificeres til at evaluere pellikkel dannelse, en form af biofilm, der udvikles, når cellerne vokser statisk i flydende kultur. Denne protokol kan også være nyttigt i vurderingen af andre indikatorer for biofilmdannelse, herunder indarbejdelse af specifikke farvestoffer i de plettede kolonier i løbet af biofilm udvikling. Disse indbefatter, men er ikke begrænset til, farvestoffer, såsom Congorødt og calcoflueller som kan binde til cellulose, en almindelig bestanddel af bakterielle biofilm 16. Desuden er denne protokol, men er udviklet til brug sammen med V. fischeri, er ikke begrænset til denne organisme, men kan generaliseres til at studere biofilmdannelse i mange forskellige organismer, såsom Bacillus subtilis 4, Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6 og Pseudomonas aeruginosa 7, som alle udviser rynkede kolonidannelse. Endelig er det også kan tilpasses til at studere andre kolonistimulerende morfologier, der har en udviklingsmæssig mønster, såsom potentielt det mønster, der opstår under vækst af Myxococcus xanthus 17 og antennen struktur udvikling Pseudomonas aeruginosa 18. Denne protokol er således af almindelig brug for mikrobiologi og biofilm forskere.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NHI R01 tilskud GM59690 tildelt KLV.
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope | Zeiss | 45505300000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes C10PLUS | JENOPTIK Optical Systems GmbH | 017953-602-26 | Camera attachment (obtained through Lukas Microscope) |
CL 1500 EC Cold Light Source | Zeiss | 4355400000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes CapturePro | JENOPTIK Optical Systems GmbH | Free software with registered camera | Computer program for image capture |
Image J | NIH | Free software from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | Computer program for diameter measurements |