Un modello umano tube di Falloppio per le Indagini su<em> C. trachomatis</em> Infezioni

Summary

Si descrivono un<em> Ex vivo infezione</em> Modello per la visualizzazione delle interazioni dirette da agenti patogeni batterici con cellule umane tuba di Falloppio. L'intero modello di tessuto organo è stato istituito per indagare<em> C. trachomatis</em> Patologia indotta al tubo di Falloppio femminile in "vita-come" condizioni.

Abstract

Infezioni del tratto genitale con Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) sono le più frequenti malattie sessualmente trasmesse nelle donne in tutto il mondo. Gioco inefficiente o persistenza dei patogeni può portare a salire infezioni del tratto superiore dell'apparato genitale e si suppone di provocare danni cronica infiammatoria a ^1,2 tessuti infetti. Di conseguenza, gravi sequele cliniche come la malattia infiammatoria pelvica (PID), occlusione tubarica e infertilità può verificarsi ^3,4.

La maggior parte della ricerca con C. trachomatis è stata condotta in linee cellulari epiteliali (ad esempio HEp-2 e cellule HeLa-229) o nei topi. Tuttavia, come coltura cellulare i modelli base, essi non riflettono la fisiologia del tessuto nativo, né la fisiopatologia della C. trachomatis infezioni del tratto genitale in vivo ^5. Ulteriori limitazioni sono dati dal fatto che centrali cascata di segnalazione (per es IFN-γ mediated JAK / STAT pathway di segnalazione) che controllano la crescita intracellulare da Chlamydia sono fondamentalmente diverse tra i topi e gli esseri umani ^6,7. Noi e gli altri quindi istituito un intero modello di tuba di Falloppio organo di indagare le interazioni dirette tra C. trachomatis e umano di Falloppio tubo di cellule ex vivo ^8,9.

Per questo scopo, umani tube da donne sottoposte a isterectomia sono stati raccolti e infettati con C. trachomatis sierotipo D. Entro 24 ore dopo l'infezione, dove campioni analizzati mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per rilevare Chlamydia trachomatis mediato danno epiteliale e C. trachomatis formazione di inserimento nel tessuto di Falloppio.

Protocol

1. Preparazione del magazzino Chlamydia trachomatis serovar D Infect confluenti 175 centimetri 2 pallone di coltura cellulare contenente cellule HeLa-229 con 4 ml C. D trachomatis in SPG tampone. Incubare per un'ora a 37 ° C durante agitazione costante. Aggiungere 20 ml di DMEM con 10% FCS e 240 cicloeximide pl. Incubare in un incubatore umidificato per 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2. Aggiungere 5 palline di vetro sterili ml, si stringono forte per staccare e distruggere C. trachomatis ospitare 229 cellule HeLa-. Raccogliere il surnatante e aggiungere un altro 5 ml di perline di vetro sterili. Roccia tre volte per 1 min a distruggere tutte le cellule HeLa-229 e il rilascio C. trachomatis. Centrifugare per 5 min a 1000 RPMI e 4 ° C per eliminare i detriti cellulari. Raccogliere il surnatante per l'infezione da 8 a 10 175 cm 2 di coltura cellulare palloni g confluentirown con 229 cellule HeLa. Incubare ogni pallone con 4 ml di tampone SPG e 4 ml di surnatante dal precedente infezione per un'ora a 37 ° C con costante agitazione. Dopo un'ora aggiungere 15 ml di DMEM con 10% FCS e 230 pl cicloeximide seguita da 48 ore di incubazione a 37 ° C e 5% CO 2. Aggiungere 5 ml di perline di vetro sterili, agitare per rimuovere e distruggere C. trachomatis ospitare 229 cellule HeLa-. Raccogliere il surnatante e aggiungere un altro 5 ml di perline di vetro sterili. Roccia tre volte per 1 min a distruggere tutte le cellule HeLa-229 e il rilascio C. trachomatis. Centrifugare per 5 min a 1000 RPMI a 4 ° C per sbarazzarsi di detriti cellulari. Raccogliere il surnatante. Riempire 40 ml di surnatante in provette da 50 ml Falcon, centrifugare per 99 min con 11.000 RPMI. Dopo la centrifugazione scartare il surnatante e lavare il pellet con 1 ml SPG buffer. Omogeneizzare lapellet in 1 ml e SPG aliquota 20 pl in uno, 1 5 ml tubo Eppendorf, conservare a -70 ° C fino all'uso. Attività biologica dello stock preparato è stato confermato in uno stabilito HeLa-229 modello di infezione delle cellule. 2. Preparazione dei diritti dell'uomo e delle tube di Falloppio Conservare i tubi di Falloppio umani (HFT) da donne sottoposte a isterectomia subito dopo l'intervento chirurgico in RPMI contenente 5% FCS senza antibiotici in 4 ° C fino alla preparazione. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Lubecca (09-153). Le donne inclusi nello studio (età 34 fino al 53) non avevano una storia di precedenti C. trachomatis infezione. Tessuti delle tube di Falloppio sono stati raccolti presso la sterilizzazione peripartum su richiesta materna durante il parto cesareo o durante l'isterectomia a causa di fibromi uterini sintomatici nella fase luteale. Tutti HFT sono risultati negativi per C. trachomatis da PCR. Sezionare il HFT in una capsula di Petri contenente RPMI con5% FCS senza antibiotici. Durante l'intera lavorazione del tessuto deve essere immersa in media per evitare l'essiccazione. Tagliare ed eliminare il tessuto connettivo e tessuto distrutto durante l'intervento. Dopo la dissezione aprire il HFT con cura con un piccolo bisturi. Per ulteriori esperimenti di preparare pezzi di tessuto nella dimensione di 0,5 cm x 0,5 cm fino a 1 cm x 1 cm. Per i campioni HFT negozio di infezione in 1 ml RPMI contenente il 5% FCS senza antibiotici. I campioni sono stati infettati con HFT 5.5×10 5 IFU (unità formanti inclusione) di C. trachomatis. Incubare campione HFT in 37 ° C, 5% CO 2 e 21% O 2, così come in 37 ° C, 5% di CO 2 e 2% O 2 per 24 h. Dopo il tempo di incubazione prelevare il campione e conservarlo in fissativo Monti per almeno tre giorni a 4 ° C fino al SEM / TEM preparazione. 3. Preparazione del campione HFT per TEM PerTEM rimuovere dal campione fissativo Monti e tagliare 2 x 2 mm a 4 mm x 5 pezzi. Il tessuto rimanente può essere utilizzato per SEM. Lavare pezzi con tampone sodio cacodilato, pH 7,35 per 1 h. Incubare in 1% (w / v) tetrossido di osmio in aqua dest. durante la notte. Rimuovere tetrossido di osmio in eccesso tramite lavaggio 6×5 min in tampone sodio cacodilato, pH 7,35. Rimuovere l'acqua incubando in concentrazioni crescenti di etanolo in acqua (v / v) (30% per 2 h, 40% per 2 h, 50% per 2 h, 60% per 2 h, 70% durante la notte, 80% per 2 h, 90% per 1 h, 95% per 1 h, 100% per 1 h. Lavare etanolo per 2 x 15 min in ossido di propilene e successivamente trasferire ad una miscela di 50% (v / v) Araldite preparata di fresco (inclusi tutti i componenti) in propilene e incubare durante la notte. Trasferimento Araldite preparata (inclusi tutti i componenti) per almeno 1 h. Trasferimento a formelle piatto e riempire con Araldite. Lasciare indurire per Aralditealmeno 48 ore a 60 ° C Dopo il taglio del campione incorporato taglio semi sezioni sottili (700 nm) su un ultramicrotomo utilizzando coltelli di vetro o un coltello isto diamanti e macchia con macchia di Richardson. Tagliare ultra-sottili sezioni (circa 70 nm) con un coltello di diamante e il trasferimento alle reti in rame (ad esempio 150 maglie quadrate). Stain ultra-sottili sezioni con acetato di uranile 0,5% (w / v) in aqua dest. seguita da 3% (w / v) citrato di piombo in acqua distillata. in sezione di coloratori automatico. In alternativa, le sezioni possono essere colorate manualmente lasciando griglie 15 min in una soluzione satura di acetato di uranile centrifugato in aqua dest. seguita da citrato di piombo 0,3% (w / v) in aqua dest. 4. Preparazione del campione HFT per SEM Per rimuovere SEM campione dal fissativo Monti, orientare con epitelio rivolto verso l'alto su un foglio di 1 x 1.5 centimetri di sughero e stabilire la posizione utilizzando aghi di insetti. Trasferimento campione sul sughero cestelli metallici adatti elavare per 30 min in tampone sodio cacodilato, pH 7,35. Rimuovere l'acqua incubando campione in crescente concentrazione di acetone / acqua (v / v) 30% per 6 h, 40% per 6 h, 60% per 8 h, 70% durante la notte, 80% per 2 h, 90% per 2% e 100 h per tutta la notte (essere estremamente cauti per mantenere campione continuamente sommerso). Trasferimento a fresco acetone 100% e campione secco mediante essiccazione punto critico (temperatura 40 ° C, pressione 80 bar). Rimuovere aghi, sughero e di campioni di colla con l'epitelio rivolto verso l'alto sul monte campione SEM dotati di una scheda di carbonio conduttivo con cemento conduttivo di carbonio. Utilizzare liquido argento conduttiva per migliorare la conducibilità tra il monte e la scheda di carbonio conduttivo. Preparare un rivestimento conduttivo platino, oro o palladio del campione con una polverizzazione spalmatrice. 5. La colorazione di sezioni sottili con Semi Stain Richardson Lasciate semi sezioni sottili a secco sul vetrino. Colorazione con sezioni soluzione colorante a 60 ° C per 1-2 min. Lavare in acqua distillata. Sezioni a secco e applicare il coprioggetto. 6. Risultati rappresentativi All'interno del modello umano Falloppio infezione tubo siamo stati in grado di visualizzare differenze nella morfologia epiteliale tra i controlli non infetti (Figura 1) e il C. trachomatis – Tubi infetti (Figura 2), in condizioni normossica. Caratteristici differenze morfologiche implicita patogeni indotta gonfiore e lisi delle cellule epiteliali del tubo di Falloppio che non potevano essere rilevati in non-infetti controlli. Uso semi sezioni sottili e microscopia elettronica a trasmissione siamo stati in grado di dimostrare intracellulare C. inclusione formazione trachomatis in ex vivo infettato tessuto umano Falloppio tubo (Figura 3, 5) ma non in non-infette controlli (Figura 4). Come concentrazione di ossigenozioni del tratto genitale femminile sono già bassi in condizioni fisiologiche 11, e diminuire ulteriormente nel corso di un processo infiammatorio abbiamo indagato anche il nostro modello in condizioni di ipossia. I risultati preliminari indicano il modello è utile per analizzare la crescita Chlamydia e la progenie in varie concentrazioni di ossigeno. Chlamydia danno indotto cellule epiteliali deve essere separato da artefatti che sono mediati attraverso incauto preparazione e la manipolazione delle tube di Falloppio prima dell'infezione (Figura 6). Figura 1. Microscopio elettronico a scansione (SEM) di un non-umano infetto Falloppio dopo un giorno di incubazione in un mezzo di controllo (freccia verde mostrano delle cellule ciliate, freccia blu mostrano non-cellule ciliate). Figura 2. Elettronico a scansione micros copia (SEM) di un ex vivo C. trachomatis infezione umana tube di Falloppio uno dopo l'infezione giorno (freccia bianca inclusione segno di rottura). Figura 3. Semi sezioni sottili mostrano tipiche inclusioni intracellulari (frecce bianche) 1g dopo l'infezione delle tube di Falloppio umana con C. trachomatis ex vivo. Figura 4. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di un non-umano infetto tube di Falloppio dopo un giorno di incubazione in mezzo di controllo. Figura 5. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di un ex vivo C. trachomatis infezione umana tube di Falloppio uno dopo l'infezione giorno (frecce bianche segnano inclusioni clamidia). ve_content "> Figura 6. Microscopio elettronico a scansione (SEM) di epitelio tube di Falloppio danneggiate attraverso la preparazione e la gestione incauta del campione (bianco frecce marchio distrutto tessuto epiteliale).

Discussion

Visualizzazione dei patogeni indotta da un danno al tessuto infetto è arduo e spesso limitata alle procedure sperimentali nei topi. Abbiamo stabilito un ex modello di infezione in vivo umani tube di Falloppio per analizzare C. trachomatis infezioni del tratto superiore dell'apparato genitale femminile. Con l'uso di questo metodo, siamo stati in grado di visualizzare C. trachomatis – danni per la salute umana indotta epitelio tube di Falloppio entro un giorno dopo l'infezione. Rigonfiamento cellulare e lisi erano tipiche alterazioni morfologiche che sono stati osservati in C. trachomatis – infetti tube di Falloppio, ma non in non-infetti controlli. Le analisi hanno rivelato che TEM clamidie implementare un tipico ciclo di sviluppo intracellulare nei tessuti infetti, che mostra le inclusioni di grandi dimensioni con corpi elementari re-differenziati, ma anche piccole inclusioni con corpi reticolati allargata che potrebbero indicare la persistenza. Tuttavia, il quadro morfologico da sola non è sufficiente per discriminare tra replinfezioni icating e persistente, che sono caratterizzati da un ridotto metabolismo e una maggiore resistenza agli antibiotici ^10.

Distruzione dell'epitelio in infetti tube di Falloppio o è dovuto alla rottura di C. trachomatis – infettate le cellule epiteliali dopo il completamento del ciclo di sviluppo e il rilascio intracellulare di malattie infettive corpi elementari o il rilascio di citochine pro-infiammatorie ^8. Patogeni indotta danni ai tessuti e le reazioni immunitarie host-indotti contro C. trachomatis dovrebbero essere i principali fattori che portano alla perdita della funzione delle cellule epiteliali, fibroblasti e rimodellamento infertilità tubarica, infine in vivo ^8,11.

Uno dei limiti principali di questo modello è l'assenza di cellule infiammatorie che ostacola l'analisi degli effetti secondari al iniziale C. infezione da trachomatis dell'epitelio tuba di Falloppio. Tuttavia, il modello è appropriate per indagare diverse condizioni ambientali (ad esempio il contenuto di ossigeno) e l'iniziale host-risposta immunitaria acuta in C. infezioni trachomatis ^8,9. Ulteriori progetti sono da stabilire un modello per i test degli antimicrobici nei confronti di C. trachomatis in interi tubi di Falloppio umani e di caratterizzare gli stati metaboliche dei diversi stadi di sviluppo osservate nell'epitelio delle tube di 2 fotoni microscopia laser scanning.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM	PAA	E15-843
RPMI	PAA	R15-802
FCS	PAA	A15-101
Cycloheximide	Sigma – Aldrich
SPG Buffer	various		see recipe below
Monti’s fixative	various		see recipe below
sodium cacodylate buffer	various		see recipe below
Richardson’s stain	various		see recipe below

Recipes:

1. SPG Buffer

1. Add 75 g sucrose.
2. Add 2.47 g disodium phosphate.
3. Add 0.36 g monosodium phosphate.
4. Add 0.72 g glutamic acid.
5. Fill to 1 l with aqua dest.
6. Adjust pH to 7.3.

2. 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.35.

1. Add 42.80 g dimethylarsenic acid sodium salt.
2. Add 68.46 g sucrose.
3. Fill to 1 l with aqua dest. to get 0.2 M sodium cacodylate buffer.
4. Before use dilute solution with aqua dest. to desired concentration and adjust pH to 7.35 if necessary.

3. Monti’s fixative

1. Add 156 ml 0.12 M sodium cacodylate buffer. 3.2 Add 25 ml 25% glutardialdehyde in aqua dest.
2. Add 19 ml 10% paraformaldehyde in aqua dest.
3. Add 3 ml 3% CaCl₂ in aqua dest.
4. Adjust pH to 7.35 and fill with aqua dest. to 312 ml final solution.

4. Richardson’s stain

1. Mix equal parts of 1% methylene blue in 1% aqueous borax solution and 1% Azur II in aqua dest.