Aqui, nós detalhe uma metodologia para o isolamento rápido de células de ratinho intestinais dendríticas (DC) e macrófagos. Caracterização fenotípica de DCs intestinais e macrófagos é realizada utilizando várias cores análise de fluxo citométrico enquanto enriquecimento grânulo magnético seguido por separação de células é usado para produzir populações altamente puros para estudos funcionais.
Dentro do intestino residem populações únicas de inata e adaptativa células do sistema imunológico que estão envolvidas na promoção da tolerância para a flora comensal e antígenos alimentares enquanto concomitantemente pronta restante para montar respostas inflamatórias para 1,2 patógenos invasivos. Células apresentadoras de antígenos, particularmente DCs e macrófagos, desempenham papéis críticos na manutenção da homeostase imune intestinal através de sua capacidade de sentir e responder adequadamente à microbiota 3-14. Isolamento eficaz de DCs intestinais e macrófagos é um passo crítico para a caracterização do fenótipo e função destas células. Enquanto muitos métodos eficazes de isolar as células imunes intestinais, incluindo DCs e macrófagos, têm sido descritos 6,10,15-24, muitos dependem de longos tempos de digestões que podem influenciar negativamente célula expressão antigénio de superfície, a viabilidade das células, e / ou o rendimento celular. Aqui, nós detalhe uma metodologia para o isolamento rápido de grandes números de concretiza-seE, DCs e macrófagos intestinais. Caracterização fenotípica de DCs intestinais e macrófagos é realizada por coloração directamente isoladas células intestinais com específicos de fluorescência-rotulados anticorpos monoclonais para multi-cor análise de citometria de fluxo. Além disso, DC altamente puro e populações de macrófagos são isolados para estudos funcionais utilizando CD11c e CD11b esferas magnéticas activadas classificação celular seguido de separação de células.
Figura 3. Factores importantes para a optimização do rendimento celular e de expressão antigénio de superfície. Rendimento celular e de expressão antigénio de superfície estão directamente afectada pela duração da digestão do tecido, as características específicas da colagenase, o grau de tecido picagem, ea presença ou ausência de inflamação, o que pode afetar a integridade dos tecidos e celularidade. Digestão prol…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Aaron Rae (Emory University Departamento de Pediatria e Saúde Infantil de Atlanta Núcleo de fluxo) para separação de células. Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão AA01787001, um prêmio de Desenvolvimento de Carreira da Fundação de Crohn e Colite da América, e um Crianças Emory-Egleston de Pesquisa semente Centro de concessão de TLD
Name of the Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
1X PBS, Ca2+– and Mg2+-free | |||
Hank’s balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
Collagenase type VIII | Sigma | C2139 | |
DNase I | Roche | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
CD45-PerCP mAb (30F11) | BD | 557235 | Use at 1:100 |
CD103-PE mAb (M290) | BD | 557495 | Use at 1:100 |
FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD | 553141 | Use at 1:200 |
CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
100 μm cell strainer | BD Falcon | 352360 | |
40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352235 | Use at 1:100 |
MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Scientific | ||
LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
LSR II | BD | ||
FACSAria II | BD |