هنا، نحن من التفصيل منهجية لعزل السريع للخلايا فأر الجذعية المعوية (DCS) والضامة. يتم تنفيذ التوصيف المظهري من البلدان النامية في الامعاء والضامة باستخدام متعدد الألوان تدفق تحليل cytometric في حين تستخدم لتخصيب حبة المغناطيسي يليه الفرز الخلية لانتاج السكان نقي جدا للدراسات الفنية.
داخل الأمعاء يقيم السكان فريدة من الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية التي تشارك في تعزيز التسامح تجاه النباتات commensal ومضادات الطعام في حين تستعد بصورة متزامنة المتبقية لتركيب الاستجابات الالتهابية نحو 1،2 مسببات الأمراض الغازية. الخلايا مستضد تقديم، ولا سيما البلدان النامية والضامة، لعب أدوارا حاسمة في الحفاظ على توازن المناعة في الأمعاء عن طريق قدرتها على الإحساس والاستجابة بشكل مناسب للالجراثيم 3-14. العزلة الفعالة من البلدان النامية في الامعاء والضامة هو خطوة حاسمة في تحديد خصائص النمط الظاهري ووظيفة هذه الخلايا. في حين وصفت وسائل فعالة العديد من عزل خلايا المناعة في الأمعاء، بما في ذلك البلدان النامية والضامة، 6،10،15-24، كثير الاعتماد على الهضم الأوقات الطويلة التي قد تؤثر سلبا على التعبير الخلية المستضد السطحي، بقاء الخلية، و / أو العائد الخلية. هنا، نحن من التفصيل منهجية لعزل السريع لأعداد كبيرة من viablه، ن المعوية والضامة. ويتم توصيف المظهري من البلدان النامية في الامعاء والضامة بها تلطيخ مباشرة الخلايا المعوية المعزولة مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة محددة مضان المسمى لتحليل تدفق متعدد الألوان cytometric. وعلاوة على ذلك، يتم عزل العاصمة نقية للغاية والسكان البلاعم للدراسات الفنية والاستفادة من CD11c CD11b حبات خلية المغناطيسي تنشيط فرز يليه الفرز الخلية.
الشكل 3. وتتأثر مباشرة من العوامل الهامة لتعظيم العائد الخلية والتعبير سطح المستضد. العائد خلية والتعبير سطح المستضد من قبل مدة من هضم الأنسجة، والخصائص المميزة للكولاجيناز، ودرجة الأنسجة تنميق، ووجود أو ع?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر هارون راي (جامعة إيموري قسم طب الأطفال ورعاية الاطفال في اتلانتا الأساسية تدفق) للفرز الخلية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AA01787001، على جائزة التطوير المهني من كرون والتهاب القولون مؤسسة من أمريكا، والأطفال، Egleston إيموري في مركز SEED للمنح البحثية لTLD
Name of the Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
1X PBS, Ca2+– and Mg2+-free | |||
Hank’s balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
Collagenase type VIII | Sigma | C2139 | |
DNase I | Roche | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
CD45-PerCP mAb (30F11) | BD | 557235 | Use at 1:100 |
CD103-PE mAb (M290) | BD | 557495 | Use at 1:100 |
FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD | 553141 | Use at 1:200 |
CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
100 μm cell strainer | BD Falcon | 352360 | |
40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352235 | Use at 1:100 |
MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Scientific | ||
LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
LSR II | BD | ||
FACSAria II | BD |