כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של המעיים עכבר תאים דנדריטים (DCS) ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע באמצעות ריבוי צבעים ניתוח תזרים cytometric תוך העשרת חרוז מגנטי ואחריו מיון התא משמש להניב אוכלוסיות טהורות ביותר ללימודי תפקודית.
בתוך המעי מתגוררים אוכלוסיות ייחודיות של תאים חיסוניים מולד אדפטיבית המעורבים בקידום הסובלנות כלפי פלורה commensal ו אנטיגנים מזון תוך במקביל צפוי להישאר לעלות תגובות דלקתיות כלפי 1,2 פתוגנים פולשניים. תאים מציגי אנטיגן, במיוחד DCS ומקרופגים, ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על הומאוסטזיס החיסון במעי באמצעות יכולתם לחוש כראוי להגיב החיידקים 3-14. בידוד יעיל של DCS ומקרופגים מעיים הוא שלב קריטי לאפיון הפנוטיפ ותפקוד של תאים אלה. בעוד שיטות יעילות רבות של בידוד תאים חיסוניים מעיים, כולל DCS ומקרופגים, תוארו 6,10,15-24, רבים מסתמכים על פי digestions ארוכים שעלולים להשפיע לרעה על שטח פני התא אנטיגן הביטוי, כדאיות התא, ו / או תשואה התא. כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של מספר רב של viabl, דואר DCS מעיים ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע ישירות על ידי מכתים תאים במערכת העיכול מבודדים עם ספציפיים נוגדנים חד שבטיים הקרינה, שכותרתו עבור ניתוח רב צבע זרימת cytometric. יתר על כן, DC טהור מאוד מקרופגים אוכלוסיות מבודדות ללימודי תפקודית ניצול CD11c ו CD11b מגנטי פעילה חרוזים סלולריים מיון ואחריו מיון התא.
איור 3. גורמים חשובים עבור אופטימיזציה של התשואה התא אנטיגן ביטוי על פני השטח. תשואה תא אנטיגן ביטוי פני מושפעים ישירות על ידי כל תקופת עיכול רקמות, המאפיינים הספציפיים של collagenase, תואר של רקמות מיותרות, ונוכחות או העדר דל…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים אהרון ריי (אוניברסיטת אמורי המחלקה לרפואת ילדים בריאות לילדים של Core תזרים אטלנטה) עבור מיון התא. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק AA01787001, פיתוח קריירה פרס מ קרוהן קוליטיס קרן של אמריקה, מרכז המחקר אמורי-Egleston לילדים זרע מענק TLD
Name of the Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
1X PBS, Ca2+– and Mg2+-free | |||
Hank’s balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
Collagenase type VIII | Sigma | C2139 | |
DNase I | Roche | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
CD45-PerCP mAb (30F11) | BD | 557235 | Use at 1:100 |
CD103-PE mAb (M290) | BD | 557495 | Use at 1:100 |
FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD | 553141 | Use at 1:200 |
CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
100 μm cell strainer | BD Falcon | 352360 | |
40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352235 | Use at 1:100 |
MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Scientific | ||
LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
LSR II | BD | ||
FACSAria II | BD |