Le processus de monstre vert pour la génération de souches de levure portant la délétion de gènes multiples

Summary

La méthode de Green Monster permet l'assemblage rapide de suppressions multiples marqués d'un gène rapporteur codant pour la protéine fluorescente verte. Cette méthode est basée sur la conduite des souches de levures par des cycles répétés de l'assortiment sexuelle des suppressions et basée sur la fluorescence d'enrichissement de cellules portant des délétions plus.

Abstract

Phénotypes pour une délétion du gène sont souvent révélée que lorsque la mutation est testé dans un fond génétique particulier ou ^1,2 état ​​de l'environnement. Il ya des exemples où de nombreux gènes doivent être supprimés pour démasquer les fonctions des gènes cachés ^3,4. Malgré le potentiel de découvertes importantes, les interactions génétiques impliquant trois ou plusieurs gènes sont en grande partie inexploré. Une recherche exhaustive de plusieurs mutants interactions serait impossible, en raison de la multiplicité des combinaisons possibles de suppressions. Cependant, les études d'ensembles sélectionnés de gènes, tels que les jeux de paralogues avec une plus grande chance de partager priori une fonction commune, serait instructive.

Dans la levure Saccharomyces cerevisiae, inactivation du gène est réalisée par le remplacement d'un gène d'un marqueur de sélection par recombinaison homologue. Parce que le nombre de marqueurs est limitée, des méthodes ont été développées pour enlever et réutiliser le sam marqueur e ^{5,6,7,8,9,10.} Cependant, les mutations d'ingénierie séquentielle multiples en utilisant ces méthodes est temps parce que le temps nécessaire échelles linéairement avec le nombre de suppressions d'être généré.

Ici, nous décrivons la méthode de Green Monster régulièrement ingénierie suppressions multiples dans la levure ^11. Dans cette méthode, une protéine fluorescente verte (GFP) journaliste intégré suppressions est utilisé pour les souches d'étiquette quantitativement en fonction du nombre de suppressions contenues dans chaque souche (figure 1). Cycles répétés de gamme de la GFP marqués par des suppressions conjugaison de la levure et de la méiose couplé avec cytométrie de flux enrichissement de souches transportant plus de ces suppressions conduire à l'accumulation de délétions dans des souches (figure 2). Effectuer des traitements multiples en parallèle, chaque processus comprenant une ou plusieurs délétions par tour, réduit le temps nécessaire pour la construction de la souche.

contenu "> La première étape consiste à préparer haploïdes simples mutants appelé« ProMonsters, «dont chacun porte un rapporteur GFP dans un locus supprimé et l'un des« boîte à outils »loci-soit-GMToolkit un monstre vert ou GMToolkit-α à l' . can1Δ locus (figure 3) En utilisant des souches de la collection suppression de levure ^12, GFP-marqués délétions peuvent être facilement généré par le remplacement de la cassette de kanMX4 commun qui sont dans ces souches avec une GFP universel – URA3 fragment Chaque GMToolkit contient:. supporte la une – ou α-accouplement du type spécifique de marqueur de sélection haploïde ¹ et exactement un des deux marqueurs qui, lorsque les deux sont présents GMToolkits, collectivement permettent la sélection des diploïdes.

La deuxième étape consiste à effectuer le cycle sexuel par lequel locus d'effacement peuvent être combinés dans une seule cellule par l'assortiment aléatoire et / ou recombinaison génétiques méiotiquemination qui accompagne chaque cycle de l'accouplement et de la sporulation.

Protocol

1. Génération de ProMonsters Préparer la cassette GFP universelle de remplacement en amplifiant un tetO 2-GFP marqueur et le marqueur URA3 du plasmide pYOGM012 (résistance à l'ampicilline) en utilisant des amorces de séquences: GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG et GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (régions en gras fournir une homologie avec les régions adjacent…

Representative Results

Quand une souche haploïde a-bord quatre suppressions GFP-marqués (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) a été croisée avec une souche haploïde α-portant quatre suppressions (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), avec deux délétions (ycl033cΔ yer042wΔ) partagée par deux souches, un représentant résultat a été obtenu. Le mélange accouplement a été cultivée dans un milieu contenant du G418 YPDA et Nat pour sélectionner diploïdes. Les diploïdes obtenu…

Discussion

Comme nous l'avons développé l'approche Green Monster, nous étions préoccupés par la possibilité d'une recombinaison entre différentes cartouches de rechange GFP, ce qui conduit à un réarrangement du génome. Atténuer contre cette possibilité est notre sélection des cellules qui ont subi avec succès plusieurs séries d'accouplement et de la méiose. Les cellules porteuses de génomes réarrangés sont censés être moins en forme après l'accouplement aux cellules sans un réarrangement …

Materials

Name of the reagent or instrument	Company	Catalogue number	Comments (optional)
G418	Sigma-Aldrich	A1720	Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 200 mg/ml. Store at 4 °C.
ClonNAT (nourseothricin)	WERNER BioAgents	5001000	Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 100 mg/ml. Store at 4 °C.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891	Dissolve in 50% ethanol and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 10 mg/ml. Make fresh every four weeks. Shield from light using aluminum foil and store at 4 °C.
Zymolyase	ZymoResearch	E1005
Difco yeast nitrogen base w/o amino acids	BD	291940
Revolver (rotator for tubes)	Labnet	H5600
Enduro Gel XL electrophoresis unit	Labnet	E0160
Sonifier 450	Branson	101-063-198
Microtip for Sonifier 450	Branson	101-148-062
FACSAria cell sorter	BD
MoFlo cell sorter	Beckman-Coulter
Biomek FX or equivalent robot	Beckman Coulter		Optional. For setting up genotyping PCRs.